Immunofenotipizzazione e gene Xist nell'AML (Xist)

La leucemia mieloide acuta (LMA) è una malattia eterogenea caratterizzata dall'espansione clonale dei progenitori mieloidi (blasti) nel midollo osseo e nel sangue periferico. con elevata mortalità e prognosi variabile. L'AML è la leucemia acuta più comune negli adulti, rappresentando circa l'80% dei casi in questo gruppo. Ci sono circa 19.520 nuovi casi di AML negli Stati Uniti (USA) ogni anno e 10.670 decessi per AML. In Egitto, l'incidenza di AML era dello 0,96% per i maschi e dell'1,14% per le femmine secondo i risultati del National Population-Based Registry Program of Egypt (2008-2011). Diagnosi di LMA basata sulla diagnosi morfologica con proliferazione di blasti ≥ 20% delle cellule midollari, immunofenotipizzazione citometrica a flusso e anomalie citogenetiche.

L'immunofenotipizzazione tramite citometria a flusso comprende un'ulteriore tecnica rapida per prevedere l'esito dell'AML, sebbene solo pochi marcatori siano ancora stabiliti come fattori prognostici nella diagnosi clinica di routine, nonostante il fatto che siano necessari marcatori nuovi e rapidamente disponibili per migliorare le decisioni terapeutiche nei pazienti con LMA. Questo è ancora di più dal momento che la terapia nei pazienti con LMA deve essere iniziata immediatamente dopo la diagnosi. I blasti di leucemia mieloide acuta esprimono antigeni trovati anche su cellule mieloidi immature sane, compresi i marcatori di differenziazione comune (CD) CD13, CD33 e CD34. Altri marcatori cellulari sono espressi a seconda del sottotipo morfologico di AML e dello stadio del blocco di differenziazione come marcatori di differenziazione monocitica (CD4, CD14, CD11b, CD11c, CD64, CD36), eritroide (CD36, CD71) e marcatori megacariocitici (CD41a e CD61) .

Anomalie cromosomiche non casuali (ad esempio, delezioni, traslocazioni) sono identificate in circa il 52% di tutti i pazienti adulti con LMA primaria e sono state a lungo riconosciute come gli eventi genetici che causano e promuovono questa malattia. Alcune anomalie citogenetiche, tra cui t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q12) e inv(16)(p13.1;q22) sono associati a remissione e sopravvivenza più lunghe, mentre le alterazioni dei cromosomi 5, 7, cariotipo complesso (descritto come >3 anomalie cromosomiche) e 11q23 sono associate a scarsa risposta alla terapia e sopravvivenza globale più breve.

Diversi studi hanno riportato correlazioni di marcatori espressi in modo aberrante con esito clinico nell'AML. Ad esempio, l'espressione di CD7 e CD25 è stata associata a prognosi sfavorevole nella LMA con cariotipo normale (NK). Il recettore IL3 alfa (CD123) è sovraespresso nel 45% dei pazienti con LMA e questa espressione più elevata è stata anche associata a scarsi risultati e correlata a mutazioni nel gene del recettore della tirosin-chinasi simile a fms (FLT3). Un profilo antigenico coerente con un'elevata espressione di CD33 è stato anche associato all'AML con nucleofosmina mutata (NPM1). I risultati di Lo-Coco et al., (2015) suggeriscono che gli immunofenotipi associati alla leucemia CD34/25/123/99+ve (LAIP) sono strettamente associati alle cellule positive per FLT3-ITD. Questa identificazione attraverso la citometria a flusso multiparametrica alla diagnosi di un'impronta immunofenotipica associata a questi sottocloni è uno strumento nuovo e semplificato con una maggiore sensibilità per svelare questi cloni e consentire la stratificazione del paziente e il trattamento adattato al rischio con potenziale impatto sull'esito della malattia.

Allo stato attuale, l'agente eziologico e la patogenesi dell'AML non sono del tutto chiari, solo pochi casi di AML possono essere accuratamente classificati attraverso la tradizionale classificazione morfologica cellulare. Pertanto, è molto difficile giudicare la condizione della malattia e prevedere la prognosi. L'espressione impropria di geni specifici è una scoperta comune nell'AML e può indurre sottoinsiemi biologici clinicamente rilevanti. Di conseguenza, l'identificazione di nuovi biomarcatori che potrebbero prevedere l'esito o guidare la scelta del trattamento contribuirà maggiormente alla gestione clinica dell'AML.

Le aneuploidie del cromosoma X sono state a lungo associate ai tumori umani, ma la causalità non è stata stabilita. Nei mammiferi, l'inattivazione del cromosoma X (XCI) è innescata dall'RNA del trascritto specifico X-inattivo (Xist) per equalizzare l'espressione genica tra i sessi. Nell'uomo, un cromosoma X viene inattivato (Xi) in ogni cellula femminile per raggiungere l'equilibrio trascrizionale. Un centro di inattivazione legato all'X (XIC) è responsabile dell'inizio dell'inattivazione dell'X. La dimensione esatta di XIC non è chiara ma include Xistgene a Xq13.2. Questo codifica un grande RNA non codificante che è inizialmente espresso su entrambi i cromosomi X prima di cessare l'espressione sull'X attivo e diventare sovraregolato sull'X che deve diventare inattivato. Il prodotto Xist RNA ricopre il futuro cromosoma Xi, diffondendosi dall'XIC.

L'RNA trascritto specifico X-inattivo è stato uno dei primi RNA lunghi non codificanti (lncRNA) ad essere scoperto all'inizio degli anni '90, un decennio prima che il Progetto Genoma Umano (HGP) rivelasse che la grande maggioranza del nostro genoma rappresenta sequenze non codificanti. Xist è un trascritto normativo di 19 kb, impiombato e non tradotto che ricopre il cromosoma X da cui è espresso in cis. Xist RNA è il principale regolatore di XCI, il processo epigenetico che equalizza il dosaggio dei geni legati all'X tra i mammiferi femmina (XX) e maschio (XY). La delezione del gene Xist provoca un'inattivazione distorta del cromosoma X di tipo selvaggio, indicando che questo locus è essenziale per il silenziamento genico.

I primi studi transgenici hanno anche svelato due caratteristiche chiave della funzione di Xist. In primo luogo, la capacità di Xist RNA di attivare il silenziamento genico è strettamente dipendente dal contesto dello sviluppo. In secondo luogo, Xist ha compiti diversi, come la localizzazione cis nel cromosoma da cui è espresso e la capacità di attivare il silenziamento genico, e questi compiti sono mediati da domini geneticamente indipendenti dell'RNA. Inoltre, il silenziamento inappropriato dell'Xist umano si traduce in cellule staminali qualitativamente aberranti. Mentre Xist è stato ampiamente studiato nella coltura cellulare, gli studi in vivo sono stati limitati, tuttavia nessuno di questi studi è stato condotto sull'uomo.

In alcuni casi, è stata osservata errata localizzazione dell'RNA Xist e riattivazione sporadica di Xi. Ad esempio, uno studio su una linea cellulare di carcinoma ovarico ha mostrato un'interruzione dell'espressione di Xist e una potenziale riattivazione del gene Membrane Palmitoylated Protein-1 (MPP1) (p55). Uno studio precedente ha dimostrato che il cromosoma X inattivo è geneticamente instabile nel cancro poiché questo studio riporta un tasso di mutazioni più elevato sull'X inattivo rispetto al resto del genoma.

La delezione Xist nel compartimento sanguigno dei topi ha dimostrato che le femmine mutanti hanno sviluppato una neoplasia mieloproliferativa altamente aggressiva e una sindrome mielodisplastica (MPN/MDS mista) con penetranza del 100%. Componenti significative della malattia includono mielofibrosi primaria, leucemia, sarcoma istiocitico e vasculite. Hanno scoperto che i cambiamenti proliferativi e displastici erano presenti in tutti i tipi di cellule ematopoietiche. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) carenti di Xist hanno mostrato una maturazione aberrante e una perdita dipendente dall'età di HSC a lungo termine.

Il loro studio implica che i tumori ematologici umani possono derivare da un sovradosaggio di X, dalla perdita di Xist su Xi o dalla duplicazione di Xa. E hanno proposto che la cancerogenesi sia guidata da una serie di cambiamenti che si verificano nell'HSC e si accumulano ulteriormente nelle cellule ematopoietiche mature. Questi cambiamenti sono avviati dalla perdita di Xist, che porta alla progressiva riattivazione di X, che a sua volta induce una cascata di cambiamenti sfavorevoli a livello del genoma che includono la disregolazione dei geni coinvolti nella replicazione del DNA, la segregazione cromosomica, i checkpoint del ciclo cellulare e l'ematopoiesi. Un fallimento della maturazione delle HSC e la perdita di HSC a lungo termine nel midollo spostano progressivamente l'ematopoiesi in siti extramidollari con conseguente emopoiesi extramidollare (EMH), collegando così causalmente il cromosoma X al cancro nei topi. Pertanto, hanno concluso che Xist RNA non solo è necessario per mantenere XCI, ma sopprime anche il cancro in vivo.

In effetti, il ruolo emergente del dosaggio genico aberrante nelle malattie, sia del cromosoma X che per gli autosomi, porta con sé la possibile applicazione di farmaci che incidono sui regolatori epigenetici in potenziali strategie terapeutiche.

Ad oggi, non ci sono studi pubblicati sull'uomo sul gene Xist e sulla sua relazione con l'immunofenotipizzazione nei pazienti con LMA. Quindi, questo sarà il primo studio progettato per spiegare il suo percorso inesplorato nell'AML e rilevare il suo ruolo prognostico e l'associazione immunofenotipica.