¿Es la infección por Helicobacter Pylori una causa o una falla en el tratamiento de la anemia por deficiencia de hierro en niños en Bangladesh?

Proponemos de estudio complementario:

1. Se propone un ensayo de campo prospectivo, doble ciego, controlado con placebo en doscientos sesenta niños de una comunidad periurbana cerca de la ciudad de Dhaka.
2. La evaluación de la absorción de hierro antes y después de la terapia antiinfecciosa en 20 niños con infección por H. Pylori y anemia por deficiencia de hierro

3. Prueba de campo

   1.1 Descripción de la población de estudio Se reclutarán niños de Nandipara, una comunidad periurbana situada a 7 millas al noreste de la ciudad de Dhaka. Esta comunidad tiene una población de 3500 habitantes en un área de aproximadamente 2.5 millas cuadradas. Entre los residentes, el 70% de los hombres se clasifican como jornaleros, el 20% son tiradores de rickshaw y el 5% son carpinteros o titulares de servicios. El quince por ciento de las mujeres son jornaleras y el 85% son amas de casa. El tamaño medio de la familia es de 4,5 miembros. El barrio marginal tiene un suministro de agua municipal para beber y cocinar y la mayoría de las familias viven en casas mal construidas. La gran mayoría de las casas tienen paredes de barro con techos de hojas secas y bambú o hojalata. La población menor de cinco años es de unos 700. La prevalencia de infección por H. pylori en menos de cinco niños en esta comunidad es del 50%.44 El Centro Internacional para la Investigación de Enfermedades Diarreicas, Bangladesh (ICDDR,B) ha administrado una clínica semanal para casos menores de enfermedades en la población desde 1986.

   Inicialmente, todos los niños de la comunidad serán examinados para detectar anemia por deficiencia de hierro e infección por H. pylori. Tras la explicación del estudio y de las pruebas, se obtendrá el consentimiento informado de los padres o tutores legales. Se registrará la información demográfica que incluye nombre, fecha de nacimiento, sexo, peso, altura, estado económico de los padres, naturaleza de la alimentación y medicación previa en el último mes.

   Detección de anemia por deficiencia de hierro Se evaluará la concentración de hemoglobina (Hgb) en muestras de sangre capilar de 50 µl obtenidas por punción en el dedo. La medición de la concentración de hemoglobina es la prueba más útil en la detección de la anemia por deficiencia de hierro, ya que refleja directamente la cantidad del compuesto de hierro esencial más abundante en el cuerpo. Los niños con una concentración de hemoglobina inferior a 110 g/l se considerarán anémicos. En niños con niveles bajos de Hgb identificados a través de la evaluación inicial, el diagnóstico de anemia por deficiencia de hierro se confirmará mediante venopunción de Hgb, concentración de ferritina sérica y concentración de receptor de transferrina sérica. La concentración de hemoglobina puede disminuir transitoriamente debido a inflamación o infección, y en tal situación no indica anemia patológica. De todas las pruebas bioquímicas para evaluar el estado del hierro, un SF bajo es la prueba más específica para la deficiencia de hierro. La principal desventaja de SF es que se eleva fácilmente en respuesta a cualquier condición inflamatoria infecciosa. Una de las principales ventajas de sTfR es que, a diferencia de SF, sTfR no se ve afectado significativamente por la infección o el proceso inflamatorio. Sin embargo, los niveles de sTfR aumentan en situaciones de mayor recambio de glóbulos rojos, como anemia hemolítica, es decir, talasemia, etc. Un valor de corte uniforme de >8,5 mg/l indica un sTfR elevado y, por lo tanto, deficiencia de hierro o anemia hemolítica.

   La medición de los receptores de transferrina en suero también se convierte en una nueva prueba prometedora para la evaluación del estado del hierro, particularmente en la evaluación epidemiológica de la anemia. Realizado junto con las mediciones de ferritina sérica, el receptor de transferrina sérica sirve para distinguir la verdadera deficiencia de hierro de la anemia de la anemia de enfermedades crónicas o enfermedades inflamatorias y, por lo tanto, ofrece una gran ventaja para establecer la verdadera prevalencia de la anemia por deficiencia de hierro en estudios de población. . La combinación de hemoglobina baja, ferritina sérica baja y receptor de transferrina sérico elevado son diagnósticos de anemia por deficiencia de hierro. El diagnóstico de deficiencia de hierro se realizará cuando se cumplan los siguientes criterios: receptor de transferrina > 8,3 mg/l, concentración de ferritina sérica

   Detección de niños infectados por H. pylori Los niños anémicos serán evaluados para detectar una infección por H. pylori mediante una prueba de aliento con urea (UBT), que muchos consideran la prueba diagnóstica de referencia para la infección por H. pylori. Hemos establecido recientemente la prueba en ICDDR, B.44 En resumen, los procedimientos son los siguientes.

   Prueba de aliento con urea Se recolectará una muestra de aliento para la línea base 13 CO2 en un vacutainer después de un período de ayuno de 2 horas. A continuación, se permitirá que los niños consuman un volumen de 100 ml de leche entera. Diez minutos más tarde se administrarán 40 mg de 13 C urea (99% 13C, Tracer Technologies, Boston, Massachusetts) después de disolverlos en 25 ml de agua. Después de la administración del sustrato, las muestras de aliento se recolectarán nuevamente por duplicado después de 30 min. Las muestras se recolectarán a través de una máscara pediátrica bidireccional con una válvula de retención adjunta en un aspirador y se almacenarán para su envío a la Universidad de Alabama, para medir la concentración de 13C de un espectrómetro de masas de CO2 respiratorio. El exceso sobre la línea de base se expresará en partes por mil (delta 0/00). Una prueba de aliento en la que el exceso sobre una línea de base es de 5,00/00 a los 30 min se considerará positiva para la infección por H. pylori.

   1.2 Selección de los niños del estudio Se inscribirán en este estudio niños anémicos por deficiencia de hierro con peso para la edad >60 % del Centro Nacional de Estadísticas de Salud (NCHS), sin evidencia de enfermedades por deficiencia o infección sistémica y cuyos padres den su consentimiento informado.

   Criterios de exclusión Serán excluidos los niños con los siguientes problemas.

   • Infección aguda o proceso inflamatorio aparente
   • Signos de deficiencia de vitaminas.
   • Anemia severa (Hemoglobina
   • Desnutrición severa (marasmo, kwasiorkar marásmico o kwasiorkar)
   • Presencia de anquilostomas y/o Giardia lamblia (quiste o forma vegetativa) en un examen microscópico de heces
   • Presencia de grasa en un examen microscópico de heces.
   • Presencia de sangre oculta en las heces demostrada por la prueba de guayaco
   • Historial de tomar antibióticos o cualquier medicamento por cualquier causa en el mes anterior

   1.3 Procedimiento Se realizará una historia clínica detallada. El peso corporal y la altura se medirán al momento de la inscripción en el estudio. Los pesos desnudos se obtendrán con una precisión de 10 g usando una balanza (Gebrüder Soehnle, Murrhardt, Alemania) y se registrará la media de tres mediciones consecutivas. La longitud en decúbito se medirá en niños menores de dos años utilizando un infantómetro de tablero deslizante (Harpenden, St. Albans, Inglaterra). En niños mayores, la altura de pie debe determinarse utilizando un instrumento construido localmente en el que se extiende una cinta métrica de metal entre un reposapiés y una barra para la cabeza que tiene un nivel de líquido adjunto para asegurar una posición horizontal. La media de dos medidas de altura consecutivas con una precisión de 0,1 cm se registra como el valor observado. Las mediciones se comparan con los estándares de acuerdo con los datos del Centro Nacional de Estadísticas de Salud y el estado nutricional evaluado por Z-score. , El porcentaje de los equivalentes de la mediana de las unidades de desviación estándar se determinará y categorizará de acuerdo con el esquema de Waterlow.

   Todos los niños serán sometidos a un examen físico por parte de uno de los investigadores. Los niños serán asignados a uno de los cuatro grupos según la aleatorización:

   • grupo anti hp
   • grupo Fe
   • Grupo anti-Hp + grupo Fe
   • grupo placebo

   Para comparar la prevalencia general de la resistencia a la terapia con hierro entre los niños con deficiencia de hierro, habrá un quinto grupo compuesto por niños con anemia por deficiencia de hierro pero sin infección por H. pylori. Este grupo será tratado con terapia de hierro.

   Terapia anti Hp: Claritromicina 15 mg/kg/día dividida en dos tomas por 10 días más omeprazol 20 mg en dosis única por 14 días. ,

   Terapia con hierro: Una dosis de hierro de 3 mg/kg/día (o alrededor de 30 mg/día) como sulfato ferroso como recomienda Dallman41 se administrará en una dosis única por la mañana media hora antes de las comidas. La terapia con hierro se administrará durante 90 días.

   Jarabe de glucosa placebo

   1.3.1 Suplementación Los jarabes de intervención se administrarán diariamente en una dosis única por la mañana con el estómago vacío (media hora antes de las comidas). Los niños del grupo placebo recibirán las mismas cantidades de jarabe de glucosa. Todas las terapias se mantendrán en recipientes idénticos de color marrón oscuro y serán alimentadas por un trabajador de la salud que no estará al tanto de la naturaleza del estudio y del contenido dentro de la botella. Las ingestas de alimentos de veinticuatro horas se registrarán en un formulario precodificado mediante recordatorio dietético.

   Los niños serán seguidos durante tres meses después del final de la suplementación. La prueba de aliento con urea se repetirá al final y al mes y 3 meses después de la suplementación. Se tomará sangre venosa (500 µl) para determinación de ferritina sérica, receptor de transferrina y concentración de hemoglobina al final y después de 1 y 3 meses de suplementación. A los niños en el grupo de placebo se les dará un curso de tres meses de suplementos de hierro supervisados ​​al final del período de estudio.

   1.4 Cálculo del tamaño de la muestra El tamaño de la muestra se calcula sobre la base de (i) la prevalencia de la infección por H. Pylori, (ii) la prevalencia de la falta de respuesta a la terapia con hierro.

   Cálculo del tamaño de la muestra basado en la prevalencia de infección por H. Pylori

   Considerando la prevalencia de la infección por H. Pylori del 50 % y la anemia por deficiencia de hierro del 70 %,44 anticipamos anemia relacionada con H. Pylori en el 50 % de los bebés y niños de esta comunidad. Esperamos una reducción en la prevalencia de la anemia por deficiencia de hierro relacionada con H. Pylori después de la terapia con antibióticos más terapias con hierro en un 25 %. Para detectar una diferencia de esta magnitud al 5 % de nivel y al 80 % de potencia, el tamaño de la muestra se calcula de la siguiente manera:

   N =[P1(100-P1) +P2(100-P2)]*8/(P1-P2)2

   Donde P1= prevalencia de anemia relacionada con H. Pylori P2= prevalencia de anemia relacionada con H. Pylori después del tratamiento

   =[50(50) +25(75)] * 8 / (25)2

   =56 en cada grupo

   Con base en un estudio previo en esta comunidad, anticipamos una tasa de deserción de aproximadamente el 15%. Con a (Akramuzzaman SM, comunicación personal), el tamaño de muestra necesario será de 65 niños en cada grupo y la muestra total de niños será de 260.

   Cálculo basado en la prevalencia de pacientes que no responden a la terapia con hierro

   La observación de un estudio en curso con un programa de suplementos de hierro por vía oral en pacientes anémicos que se lleva a cabo en Dinajpur (un distrito del norte de Bangladesh) sugiere que el 70 % del grupo que recibe suplementos de hierro no responde (S. Rahman, comunicación personal). La prevalencia de la infección por H. pylori en la población de estudio propuesta es de aproximadamente el 50 %,35 y esperamos que después de la administración oral de suplementos de hierro, los no respondedores serán un 40 % menos entre el grupo negativo para H. pylori, en comparación con el grupo positivo para H. pylori. . Para detectar una diferencia de esta magnitud al 5 % de nivel y al 80 % de potencia, el tamaño de la muestra se calcula de la siguiente manera:

   N = [P1(100-P1) +P2(100-P2)]*8/(P1-P2)2

   Donde P1= prevalencia de anemia después de la suplementación con hierro en niños infectados por H. pylori P2= prevalencia de anemia después de la suplementación con hierro en niños no infectados con H. pylori

   • [(70)(30) +(42)(58)] * 8 / (35)2 =46 en cada grupo

   Con una tasa de abandono del 15 %, el número de niños será de 53 en cada grupo, es decir, una muestra total de 212 niños.

   Tomaremos el tamaño de muestra más grande, es decir, 260 niños para este estudio.

   1.5 Aleatorización Una persona debidamente capacitada que no esté relacionada con el estudio preparará un cuadro maestro de aleatorización utilizando números de bloque permutados aleatorios que toman un tamaño de tres. Los frascos que contengan terapia anti-Hp, terapia con hierro o placebo serán idénticos en apariencia y se organizarán en la secuencia que corresponda a la tabla de aleatorización y estarán numerados en serie. El número de serie de los frascos se corresponderá con el número de serie de los pacientes inscritos en el estudio. Como un grupo de niños recibiría terapia anti-Hp y terapia con hierro simultáneamente, habrá dos botellas (botellas A o B) para cada grupo de niños para hacer el estudio doble ciego. Para los niños pertenecientes a la terapia anti-Hp más Hierro, habrá un frasco que contenga la terapia anti-Hp y el otro que contenga la terapia con hierro. Los niños que solo reciben terapia con hierro o anti-Hp recibirán un frasco que contiene el medicamento, mientras que el otro contiene jarabe de glucosa. Como la duración de la terapia anti-Hp es de 14 días, a los niños pertenecientes a este grupo se les proporcionará jarabe de glucosa durante el resto del mes con el fin de igualar la duración de la terapia entre los cuatro grupos.

   1.6 Prueba de laboratorio La concentración de Hb se determinará por el método de la cianometahemoglobina, la ferritina sérica se determinará por un ensayo radioinmunométrico. El receptor de transferrina sérica se medirá mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se analizarán las heces para detectar la presencia de sangre oculta mediante la reacción de guayaco (Occultotest, Ames Co., Elkhart, Inc.,. EE.UU). El pepsinógeno sérico y la gastrina se medirán mediante radioinmunoensayo.

   1.7 Retiro del estudio - El incumplimiento del sujeto, ya sea porque abandona el área de estudio hacia otro lugar antes del final del estudio o

   - porque el niño requiere un tratamiento no programado por una infección transitoria grave.

   Tratamiento de la abstinencia durante el análisis Los resultados de todos los niños asignados al azar se incluirán en el análisis del estudio. Se incluirán los datos de los pacientes dados de baja hasta el momento de la baja. También se realizará un análisis complementario en el que se excluyan dichos pacientes.

   1.8 Variables de resultado

   Importante

   - La incidencia de infección por H. Pylori después de la terapia.

   - Aumento de la hemoglobina sérica, concentración de ferritina sérica o reducción del nivel de receptores de transferrina sérica.

   - El número de niños en cada grupo con IDA como se define principalmente antes y después de la intervención

   Menor

   - Cambio de índices antropométricos

2. Estudio de absorción de hierro Se seleccionarán veinte niños adicionales con una prueba de aliento con urea positiva y anemia por deficiencia de hierro para el estudio de absorción de hierro. Se explicará a los padres el propósito del estudio y todos los procedimientos relacionados con el estudio de absorción de hierro y se obtendrá su consentimiento. Antes de comenzar el estudio de absorción de hierro, todos los niños recibirán una fórmula comercial de leche de vaca ajustada en suero con 8 mg Fe/l (Nidina 1; Nestlé, París, Francia) durante un período de al menos tres semanas. Después de 21 días de alimentación con fórmula, serán admitidos en el Metabolic Ward of Clinical Research and Service Center.

La incorporación de eritrocitos de hierro marcado (radioestable) se ha utilizado con éxito para examinar la absorción en el intestino. El método de incorporación de eritrocitos implica la administración oral de un isótopo de hierro seguido de la medición de la proporción de isótopos de hierro en los eritrocitos en un momento seleccionado después de la administración. Seguiremos la técnica para medir la absorción de hierro en niños mediante una técnica de doble isótopo estable, desarrollada recientemente por Kastenmayer et al.

2.1 Método para el estudio de absorción de hierro

Preparación de soluciones de sulfato de hierro marcadas El óxido férrico enriquecido con 57Fe y 58Fe (Fe2O3) se adquirirá en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge (Oak Ridge, TN, EE. UU.). Las composiciones de isótopos de hierro en la preparación de 58Fe (según lo proporcionado por Oak Ridge National Laboratories) son (mg): (% en peso) 54 Fe (0,65), 56 Fe (35,6)57 Fe (3,47) y 58 Fe (60,28). Las composiciones de isótopos de hierro en el 57Fe (% en peso) son; 54Fe(0,65), 56Fe(35,60), 57Fe (3,47) y 58Fe (60,28).

El óxido férrico se disolverá en H2SO4 concentrado burbujeando monóxido de carbono a través de la solución con calor durante aproximadamente cuatro horas. Luego, la solución se reducirá pasando nitrógeno purificado a través de ella durante varios minutos. A continuación, el volumen se ajustará utilizando agua reducida. Una alícuota de dos ml de las soluciones resultantes de 57 FeSO4 y 58 FeSO4 se transferirá a ampollas opacas. Cada ampolla se purgará con nitrógeno y se sellará. Las ampollas contendrán 200 µg/ml de hierro total (como sulfato ferroso) y 150 µg/ml de 57Fe o 700 µg/ml de hierro total (como sulfato ferroso) y 420 µg/ml de 58Fe. Se usará una alícuota de una ampolla individual para preparar soluciones de trabajo enriquecidas con 57Fe y 58Fe.

Estabilidad y seguridad de las soluciones parenterales de 57 Fe Antes de la i.v. la administración a los lactantes de la solución de 57FeSO4 se someterá a pruebas de pirogenicidad, esterilidad y estabilidad. Pruebas de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) y cultivos repetidos para el crecimiento bacteriano y fúngico para confirmar que las soluciones de 57FeSO4 están libres de pirógenos y son estériles en las concentraciones que se utilizarán en el estudio. El contenido de nutrientes de las soluciones parenterales se ha descrito previamente. El contenido total de hierro de la solución nutritiva de 57FeSO4 se determinará mediante espectrometría de absorción atómica antes y después de la filtración (filtros de 0,22 µ) y con el tiempo a temperatura ambiente.

2.2 Diseño del estudio de absorción de hierro Los bebés inscritos en el estudio recibirán una combinación de alimentación parenteral y enteral. La solución de 57FeSO4 se administrará por vía parenteral mientras que el 58FeSO4 se administrará por vía enteral. Luego se medirá la incorporación de 57Fe y 58Fe en los eritrocitos a partir de muestras de sangre tomadas dos semanas después de las infusiones iniciales. El porcentaje de la dosis administrada I.V presente en los eritrocitos circulantes se utilizará como referencia para el porcentaje de hierro absorbido (de la dosis administrada por vía oral) presente en los eritrocitos circulantes. El porcentaje "corregido" de incorporación de 58Fe y 57Fe de eritrocitos (58Fe inc-cor/57Fe inc-cor) se calculará matemáticamente como se describe a continuación.

Antes de la administración iv a los niños, 0,7-0,8 Se añadirán ml de la solución de 57FeSO4 (0,2 mg/ml) a un burtrol que contenga 30 ml de la solución nutritiva utilizada para la alimentación parenteral, utilizando técnicas estériles. La mezcla de hierro y nutrientes, que se ha utilizado con seguridad anteriormente, se infundirá lentamente en una vena periférica de los niños durante un período de 12 a 24 horas con la ayuda de una bomba de infusión.

Poco después del inicio de la infusión parenteral de la solución de 57FeSO4, se administrará 58FeSO4 enteral a los niños. Durante este tiempo se continuará con la infusión parenteral de 57FeSO4. Después de verificar que la sonda de alimentación nasogástrica esté correctamente ubicada en el estómago, se aspirará la sonda para verificar el contenido del estómago. Si el estómago está vacío, se administrarán 1,5 ml del 58 FeSO4 directamente a través de una jeringa en la sonda de alimentación. A continuación, se enjuagará el tubo con 0,5 ml de agua estéril. La dosis de 57FeSO4 parenteral será de 0,15 mg/kg (solución de sulfato ferroso enriquecida con 57Fe), lo que aportaría 0,12 mg/kg de 57Fe. La dosis de enteral será de 1,5mg/kg (solución de sulfato ferroso enriquecida con 58Fe), que aportará 0,8mg/kg de 58Fe. Los niños serán dados de alta con tratamiento para la infección por Helicobacter pylori (claritromicina más omeprazol) durante 10 días.

Después de un mes de terapia, se solicitará a las madres que traigan a sus hijos al CRSC. Se realizará un nuevo estudio de UBT y absorción de hierro.

2.3 Toma de muestras de sangre Se tomarán muestras de sangre antes de la administración de los isótopos estables (línea de base) y 14 días después en ambas ocasiones. El tamaño de la muestra de sangre será de 200 a 300 µl por muestra.

2.4 Cálculo de la incorporación de hierro en los eritrocitos La cantidad administrada de 58Fe y 57Fe (mg) incorporada en los eritrocitos en el tiempo especificado 't' después de la administración de la dosis de hierro marcada se calculará de manera similar a la utilizada por Zlotkin et al 1995.

58 Fe Inc. =Rt58/54 -Ro58/54 xFe circ x 0,00322 Ro58/54

57Feinc =R157/54-Ro57/54 x Fe circ x 0,0218 Ro57/54

En esta ecuación, 58Feinc y 57Feinc se expresarán en mg. R158/54, R157/54 y R057/ 54 son las proporciones de isótopos expresadas en peso para 58Fe/54Fe y 57Fe/54Fe, que se determinarán en muestras de sangre digerida en el tiempo "t" después de la dosificación y en una línea de base (pre 58Fe y pre dosis de 57Fe) respectivamente; Fe circ es la cantidad de hierro circulante. Fe circ en el tiempo "t"; 0,0032 y 0,0218 son las abundancias naturales (fracciones en peso) de 58 Fe y 57 Fe. La cantidad de hierro circulante total, Fe circ, expresada en mg, se estimará como

Circulo Fe. = BV x Hb x 3,47

Donde BV es el volumen de sangre en litros, se supone que es 0,085 l/kg de peso corporal; Hb es la concentración de hemoglobina en g/l; 3,47 es la concentración de hierro en Hb (mg/g).

La cantidad de 58Fe o 57Fe administrado incorporado en los eritrocitos, % Fe inc, se expresará como un porcentaje de las dosis administradas de 58Fe o 57Fe. Feinc.

• 58 Fe inc = 58 Fe inc x 100 o Fe inc
• 57 Fe aum = 57 Fe aum x 100 57 Fe aum

El porcentaje de eritrocitos corregido para el análisis de las proporciones de isótopos estables en los eritrocitos se calculará usando el porcentaje de incorporación de eritrocitos de 57 Fe infundido i.v.

• 58Fe inc-cor = % 58Fe inc X 100.
• 57 Feinc

Análisis espectrométrico de masas La preparación de muestras de sangre para el análisis espectrométrico de masas y la preparación de estándares enriquecidos se seguirán según los procedimientos descritos por Kastenmayer et al. Las muestras de sangre entera heparinizada se humedecerán con HNO3 concentrado en una proporción de 1:3 (sangre: ácido)(vol/vol) en una placa caliente a fuego lento durante 20-30 min. Las soluciones digeridas se ajustarán con agua desionizada para producir una concentración de hierro de 10 µg/ml. Los estándares enriquecidos con isótopos para la calibración de un instrumento se prepararán de la misma manera que con las muestras desconocidas. Las proporciones de isótopos para 58Fe/54Fe y 57Fe/54Fe en la sangre antes y después de la administración enteral (58Fe) y parenteral (57Fe) simultánea de isótopos se determinarán mediante un espectrómetro de masas de ionización térmica controlado por computadora utilizando un sistema Elan Model 250 ICP/MS, (SCIEX, Inc., Thornhill, Ontario, Canadá), operado en el modo de proporción de isótopos, seguido por Zlotkin et al. en el Departamento de Ciencias Pediátricas y Nutricionales de la Universidad de Tronoto, Canadá.

Prueba de intubación Se realizará una prueba de intubación estándar como se describió anteriormente14 en este subgrupo de niños después de completar el estudio de absorción de hierro. En resumen, se colocará una sonda gástrica blanda (18G) en la parte más dependiente del estómago. Se recolectarán muestras de ácido gástrico de niños acostados en posición reclinada izquierda mediante succión manual. La posición de la sonda se confirmará mediante auscultación, aspiración de jugo gástrico y recuperación casi completa del agua inyectada en la sonda. Las muestras de jugo gástrico se descartarán durante los primeros 10 min posteriores a la intubación. A partir de entonces, las muestras se recogerán y guardarán en alícuotas de 15 min durante 90 min. Tras 90 min de recogida (muestra basal), se inyectará pentagastrina (peptavlon, ICI) por vía subcutánea a una dosis de 0,6 ug/kg. La muestra que sigue a la estimulación con pentagastrina durante 60 min se denominará "muestra estimulada". Se registrará el volumen de secreción gástrica en cada una de las recolecciones de 15 min y se expresará en mililitros por hora. Las concentraciones de ácido en cada uno se medirán por titulación de 1 ml de jugo gástrico con hidróxido de sodio 0,01 N a pH 7,4, usando un titulador automático (Metrohm, Herisau, Suiza). La producción de ácido total se calculó para cada pinta de tiempo multiplicando el volumen de jugo gástrico y la concentración de ácido. La producción de ácido basal (BAO) y estimulada (SAO) se calcularon en base a 2 muestras recolectadas para la medición inicial y las 4 muestras recolectadas después de la administración de pentagastrina respectivamente, y se expresaron como mMol/h.