Secuenciación paralela masiva para identificar organismos microbiológicos en líquido de lavado broncoalveolar

5.1 Los sujetos se someterán a broncoscopia y BAL según las indicaciones clínicas. Las técnicas y el equipo serán según la práctica clínica actual en Westchester Medical Center (WMC). El broncoscopio generalmente se introduce a través de una vía aérea artificial (tubo endotraqueal o vía aérea con máscara laríngea). El lavado se realiza con solución salina normal estéril. El sitio de realización del lavado se selecciona en base a los datos clínicos o radiológicos y al aspecto de las vías respiratorias durante la broncoscopia. El volumen típico del lavado es de 3 alícuotas de 1 ml/kg cada una, con un máximo de 20 ml por alícuota.

5.2 Cuando el laboratorio de WMC recibe 10 ml o más de líquido de BAL, el laboratorio de WMC dividirá el líquido de BAL para todas las pruebas de laboratorio clínico solicitadas por un médico y para las pruebas de investigación de secuenciación paralela masiva. Esto asegurará que haya suficiente material de LBA disponible para todas las pruebas clínicas.

5.3 El líquido BAL para la investigación será retenido por el laboratorio de WMC y recogido por el personal de investigación para su procesamiento en la instalación central de genómica del Colegio Médico de Nueva York.

5.4 La parte de la investigación se dividirá aún más para el aislamiento de ácido nucleico viral, bacteriano y fúngico. En paralelo, se preparará una muestra de control del líquido utilizado para el BAL. Se aislará ADN bacteriano/fúngico y ADN y ARN viral. Las bibliotecas de secuenciación del genoma completo se generarán y secuenciarán en lotes en Illumina MiSeq.

Los archivos FASTQ se desmultiplexarán y luego se alinearán con los genomas microbianos usando Phylosift.11 Las secuencias de ADN presentes tanto en el paciente como en las muestras de control se descartarán como contaminantes. Los organismos preponderantes identificados se compararán con los resultados de las técnicas basadas en cultivo utilizadas para verificar los resultados independientes del cultivo.