Sequenciamento Massivamente Paralelo para Identificar Organismos Microbiológicos no Líquido de Lavagem Broncoalveolar

5.1 Os indivíduos serão submetidos a broncoscopia e BAL com base em indicações clínicas. Técnicas e equipamentos serão de acordo com a prática clínica atual no Westchester Medical Center (WMC). O broncoscópio é geralmente introduzido através de uma via aérea artificial (tubo endotraqueal ou máscara laríngea). A lavagem é realizada com solução salina normal estéril. O local de realização da lavagem é selecionado com base em dados radiológicos ou clínicos e no aspecto das vias aéreas durante a broncoscopia. O volume típico da lavagem é de 3 alíquotas de 1 ml/kg cada, com um máximo de 20 ml por alíquota.

5.2 Quando 10 ml ou mais de fluido BAL são recebidos pelo laboratório WMC, o fluido BAL será dividido pelo laboratório WMC para todos os testes laboratoriais clínicos solicitados pelo médico e para testes de pesquisa de sequenciamento massivamente paralelo. Isso garantirá que material BAL suficiente esteja disponível para todos os testes clínicos.

5.3 O fluido BAL para pesquisa será retido pelo laboratório WMC e recolhido pelo pessoal de pesquisa para processamento no New York Medical College Genomics Core Facility.

5.4 A porção de pesquisa será ainda dividida para isolamento de ácidos nucleicos virais, bacterianos e fúngicos. Uma amostra de controle do fluido usado para o BAL será preparada em paralelo. Serão isolados DNA bacteriano/fúngico e DNA e RNA viral. Bibliotecas inteiras de sequenciamento do genoma serão geradas e sequenciadas em lotes no Illumina MiSeq.

Os arquivos FASTQ serão desmultiplexados e então alinhados aos genomas microbianos usando o Phylosift.11 As sequências de DNA presentes nas amostras do paciente e do controle serão descartadas como contaminantes. O(s) organismo(s) preponderante(s) identificado(s) será(ão) comparado(s) com os resultados das técnicas baseadas em cultura usadas para verificar os resultados independentes da cultura.