Masszívan párhuzamos szekvenálás a mikrobiológiai organizmusok azonosítására a bronchoalveoláris mosófolyadékban

5.1 Az alanyokon klinikai indikációk alapján bronchoszkópiát és BAL-t vetnek alá. A technikák és felszerelések a Westchester Medical Center (WMC) jelenlegi klinikai gyakorlatának megfelelően lesznek. A bronchoszkópot általában mesterséges légúton (endotracheális tubuson vagy gégemaszkos légúton) vezetik be. Az öblítést steril normál sóoldattal végezzük. Az öblítés helyének kiválasztása radiológiai vagy klinikai adatok, valamint a légutak bronchoszkópia során kialakult megjelenése alapján történik. Az öblítés tipikus térfogata 3, egyenként 1 ml/kg-os aliquot rész, aliquot részenként legfeljebb 20 ml.

5.2 Ha a WMC laboratóriuma 10 ml vagy több BAL folyadékot kap, a BAL folyadékot a WMC laboratórium felosztja az összes orvos által rendelt klinikai laboratóriumi vizsgálathoz és a masszívan párhuzamos szekvenáló kutatási tesztekhez. Ez biztosítja, hogy elegendő BAL-anyag álljon rendelkezésre minden klinikai vizsgálathoz.

5.3 A kutatáshoz használt BAL-folyadékot a WMC laboratóriuma tartja, és a kutatószemélyzet veszi fel feldolgozásra a New York Medical College Genomics Core Facility-jében.

5.4 A kutatási részt tovább osztják a vírusos, bakteriális és gombás nukleinsav izolálása céljából. Ezzel párhuzamosan a BAL-hoz használt folyadékból egy kontrollmintát készítenek. A bakteriális/gomba DNS-t és a vírus DNS-t és RNS-t izoláljuk. Teljes genom szekvenáló könyvtárakat állítanak elő és szekvenálnak kötegekben az Illumina MiSeq-en.

A FASTQ fájlok demultiplexelésre kerülnek, majd a Phylosift segítségével hozzáigazítják a mikrobiális genomokhoz.11 A beteg- és a kontrollmintában egyaránt jelenlévő DNS-szekvenciákat szennyezőként el kell dobni. Az azonosított túlsúlyban lévő organizmus(oka)t a tenyésztésfüggetlen eredmények ellenőrzésére használt tenyészet alapú technikák eredményeivel párosítják.