Massiv parallele Sequenzierung zur Identifizierung mikrobiologischer Organismen in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit

5.1 Die Probanden werden je nach klinischen Indikationen einer Bronchoskopie und einer BAL unterzogen. Techniken und Ausrüstung entsprechen der aktuellen klinischen Praxis im Westchester Medical Center (WMC). Das Bronchoskop wird in der Regel entweder über einen künstlichen Atemweg (Endotrachealtubus oder Larynxmasken-Atemweg) eingeführt. Die Spülung erfolgt mit steriler normaler Kochsalzlösung. Der Ort der Durchführung der Spülung wird auf der Grundlage radiologischer oder klinischer Daten und des Erscheinungsbilds der Atemwege während der Bronchoskopie ausgewählt. Das typische Volumen der Spülung beträgt 3 Aliquots zu je 1 ml/kg, mit einem Maximum von 20 ml pro Aliquot.

5.2 Wenn das WMC-Labor 10 ml oder mehr BAL-Flüssigkeit erhält, wird die BAL-Flüssigkeit vom WMC-Labor für alle vom Arzt angeordneten klinischen Labortests und für massiv parallele Sequenzierungsforschungstests aufgeteilt. Dadurch wird sichergestellt, dass für alle klinischen Tests ausreichend BAL-Material zur Verfügung steht.

5.3 Die BAL-Flüssigkeit für Forschungszwecke wird vom WMC-Labor aufbewahrt und vom Forschungspersonal zur Verarbeitung in der Genomics Core Facility des New York Medical College abgeholt.

5.4 Der Forschungsteil wird weiter unterteilt in die Isolierung viraler, bakterieller und pilzlicher Nukleinsäuren. Parallel dazu wird eine Kontrollprobe der für die BAL verwendeten Flüssigkeit vorbereitet. Bakterien-/Pilz-DNA sowie virale DNA und RNA werden isoliert. Sequenzierungsbibliotheken für das gesamte Genom werden stapelweise auf dem Illumina MiSeq generiert und sequenziert.

FASTQ-Dateien werden demultiplext und dann mithilfe von Phylosift.11 an mikrobiellen Genomen ausgerichtet DNA-Sequenzen, die sowohl in den Patienten- als auch in den Kontrollproben vorhanden sind, werden als Kontaminanten verworfen. Die identifizierten vorherrschenden Organismen werden mit den Ergebnissen der kulturbasierten Techniken abgeglichen, die zur Überprüfung der kulturunabhängigen Ergebnisse verwendet werden.