Intervento sullo stile di vita in preparazione alla gravidanza (LIPP)

Obiettivo specifico 1: Indagare il significato fisiologico dell'intervento sullo stile di vita in preparazione alla gravidanza (LIPP) sul metabolismo e sull'adiposità materna e neonatale.

Introduzione/motivazione: i nostri dati preliminari dimostrano che l'intervento sullo stile di vita supervisionato porta a una significativa perdita di peso, a una migliore sensibilità all'insulina, tolleranza al glucosio e secrezione di incretine, insieme a risultati cardiovascolari e di composizione corporea più sani negli adulti in sovrappeso e obesi. Ci aspettiamo che i tempi e l'attuazione dell'intervento sullo stile di vita proposto producano benefici per la salute simili nelle donne in sovrappeso/obese che pianificano una seconda gravidanza e portino a una maggiore sensibilità all'insulina, a una ridotta secrezione di insulina e a una minore infiammazione. Questi miglioramenti si tradurranno nella prevenzione dell'eccessiva disponibilità di nutrienti (glucosio e lipidi) dal contribuire all'eccessiva crescita/adiposità fetale. L'ipotesi di lavoro per questo obiettivo è che, contrariamente al GWG, la ridotta sensibilità all'insulina pre-gravidanza nelle madri obese rappresenti la più grande varianza clinica nell'accrescimento di grasso nel neonato. Sebbene clinicamente prevediamo una diminuzione del peso e del BMI nel gruppo LIPP, il miglioramento della sensibilità all'insulina e del profilo metabolico sono le misure fisiologiche chiave correlate all'esito primario della diminuzione dell'adiposità neonatale, e non la perdita di peso di per sé.

La logica è che il momento ottimale per attuare un intervento sullo stile di vita che migliori efficacemente la salute materna a livello fisiologico, cellulare e molecolare e si traduca in un'adiposità ottimale nel bambino, è prima della gravidanza. Le donne che perdono peso dopo il parto sperimentano una diminuzione del peso alla nascita neonatale (principalmente tessuto adiposo) nella gravidanza successiva, mentre le donne che aumentano di peso sperimentano un aumento del peso alla nascita e dell'adiposità neonatale. Ipotizziamo che la condizione metabolica materna pre-gravidanza determini l'ambiente obesogenico in utero, che a sua volta influenza la programmazione placentare delle vie mitocondriali e lipidiche (Obiettivo specifico 2) e la composizione corporea del bambino. Un'ulteriore motivazione è che è necessario comprendere in che modo il miglioramento delle condizioni metaboliche pregravide influisce sulla funzione fisiologica e molecolare materna. Prevediamo che le donne obese che completano il programma LIPP entreranno in gravidanza con un migliore metabolismo regolato dall'insulina e una ridotta insulino-resistenza, facilitando così un peso alla nascita e un'adiposità neonatale inferiori. Recluteremo madri che hanno partorito il loro primo bambino all'MHMC. Riconosciamo che queste madri rappresentano una fascia demografica che ha un accesso limitato alle strutture per l'esercizio fisico o ai sistemi di supporto familiare che faciliterebbero il tempo libero per l'esercizio. Al fine di ridurre le barriere alla partecipazione, condurremo le sessioni di esercitazione nei centri ricreativi comunitari locali. I centri dispongono di strutture per l'assistenza all'infanzia e sosterremo i costi in modo che i partecipanti possano portare i loro bambini alle sessioni LIPP. Per aumentare ulteriormente la partecipazione e massimizzare la fidelizzazione, forniremo il trasporto da e per i centri ricreativi. Il supporto per il trasporto sarà richiesto al Cleveland Mt. Fondazione Sinai. Fase di perdita di peso di intervento sullo stile di vita: il programma LIPP è progettato per promuovere la perdita di peso pari al 5-10% del peso corporeo. La fase di perdita di peso di 4 mesi consiste in un allenamento aerobico con dieta e consulenza comportamentale per indurre la perdita di peso, come è stato ottenuto con successo negli studi precedenti. Inizialmente, l'esercizio supervisionato verrà prescritto al 55-60% della FCmax e gradualmente aumentato in modo che dopo 1-2 settimane i soggetti si allenino al 75-85% della FCmax (~65-70% VO2max). L'esercizio supervisionato consisterà in camminata/corsa su tapis roulant e cyclette, 3 giorni/settimana, 60 min/sessione (ovvero 500 kcal/sessione). Le donne indosseranno monitor della frequenza cardiaca (FC) (Polar Electro, Woodbury, NY) durante ogni sessione di allenamento in modo da avere un feedback visivo del loro obiettivo di frequenza cardiaca target personalizzato. Ai partecipanti verrà consigliato di ridurre l'apporto calorico di ~ 500 kcal/d per sostenere i loro obiettivi di perdita di peso. La dieta raccomandata fornirà circa il 55% delle calorie come carboidrati, il 25% come grassi e il 20% come proteine. I partecipanti saranno istruiti a consumare carboidrati complessi e ad evitare zuccheri semplici. Il fabbisogno calorico specifico sarà stimato mediante calorimetria indiretta e un fattore di correzione dell'attività fisica sedentaria (x1.3). L'assunzione di energia sarà stimata utilizzando l'app del diario fotografico del cibo, Meal Snap. La fotografia digitale fornisce una stima eccellente dell'assunzione di energia (67). I partecipanti che non possiedono uno smartphone ne avranno uno fornito grazie al supporto della Cleveland Foundation.

I record che coprono un periodo di dieta di 72 ore saranno condivisi con il gruppo di ricerca per la determinazione dell'apporto calorico e nutrizionale. Meal Snap ha un database alimentare di oltre 350.000 articoli. Tuttavia, alcuni pasti non saranno presenti in questo database, pertanto i nostri Lifestyle Coach inseriranno tutti gli alimenti consumati nel nostro database dietetico (NDSR, Minneapolis, MN) per facilitare l'analisi delle calorie e dell'apporto di macro/micronutrienti. I soggetti genereranno foto prima e dopo il pasto per stimare la quantità di cibo che è stato mangiato. I dati saranno ottenuti al basale e a intervalli di 2 settimane durante il periodo iniziale di perdita di peso supervisionato di 16 settimane.

Intervento sullo stile di vita - Gestione/mantenimento del peso: il programma di gestione del peso pre-gravidanza (fase 2A, 2B e 2C) è progettato per facilitare obiettivi di perdita di peso personalizzati utilizzando comportamenti di stile di vita che includono esercizio fisico, dieta e modifiche comportamentali e si basa in parte su il processo Look AHEAD. L'intervento include un concetto di cassetta degli attrezzi per aiutare a raggiungere gli obiettivi di perdita di peso. I Lifestyle Coach forniranno istruzioni personalizzate sull'attività fisica/esercizio - 10.000 passi/giorno, e i partecipanti useranno FitBit Flex (Fitbit.com), per tenere traccia del conteggio dei passi e del tempo di esercizio. Durante la prima fase di mantenimento del peso (2A) le donne parteciperanno a 2 sessioni di gruppo supervisionate/settimana. Queste sessioni includono esercizi strutturati (ad es. Zumba, jazzercise, passeggiate con il passeggino), revisione dei registri fotografici dietetici, dove sono stati consumati i pasti (a casa o fuori; registrati sull'app per smartphone) e consulenza comportamentale (con il loro Lifestyle Coach). I partecipanti saranno incoraggiati a mangiare 1.200-1.500 kcal/die (~55% di carboidrati, 25% di grassi, 20% di proteine) se inferiori a 113 kg o 1.500-1.800 kcal/die se >113 kg. I dati dietetici saranno analizzati a intervalli di 4 settimane durante il periodo di mantenimento del peso. È importante sottolineare che, per ridurre al minimo il carico del soggetto e massimizzare la conservazione e l'acquisizione dei dati, il Lifestyle Coach monitorerà l'apporto calorico utilizzando il diario fotografico del partecipante. Le strategie comportamentali per motivare decisioni su uno stile di vita sano includeranno: automonitoraggio (cibo, attività e peso, utilizzando le risorse online di FitBit), definizione degli obiettivi (passi/giorno, perdita di peso), controllo degli stimoli (ad es. vs. stare in piedi), problem solving (disporre di spuntini, esercizio fisico a casa) e prevenzione delle ricadute (ovvero vacanze, alcol, fast food, dolci, alimenti problematici, alimentazione compulsiva). Dopo 4 mesi e la perdita di peso desiderata, i soggetti passano alla Fase 2B. Durante questa fase i soggetti mantengono un obiettivo di esercizio di 10.000 passi/giorno, ma dovranno partecipare solo a 1 sessione supervisionata/settimana. Se un soggetto non riesce a mantenere la perdita di peso, definita come aumento di peso del 3% del peso corporeo attuale, i partecipanti torneranno alla Fase 2A per una gestione del peso più supervisionata. In alternativa, se la perdita di peso viene mantenuta dopo 3 mesi, i soggetti passeranno alla Fase 2C fino alla successiva gravidanza. La fase 2C consiste in sessioni di allenamento senza supervisione. Tuttavia, il soggetto e il Lifestyle Coach converseranno settimanalmente per telefono per rivedere i progressi, inclusi i dati sugli esercizi Fitbit e la dieta. I dati suggeriscono che i programmi di gestione del peso forniti per telefono sono paragonabili ai programmi forniti clinicamente. Durante le chiamate ai partecipanti verrà consigliato di continuare a esercitare all'intensità e alla durata prescritta durante la Fase 2B. Saranno forniti di cibo specifico per la lingua e diario di esercizi. Questi verranno utilizzati per guidare l'assunzione di calorie e forniranno un altro record di conformità. I partecipanti randomizzati al gruppo di controllo riceveranno informazioni sulla dieta post-gravidanza/perdita di peso dal nutrizionista CRU in modo distinto dal nutrizionista LIPP (HB) per ridurre la contaminazione incrociata tra i gruppi. Gestione del peso durante la gravidanza: tutti i LIPP e i gruppi di cura / controllo abituali saranno seguiti dal loro fornitore ostetrico primario. Il dipartimento di ostetricia/ginecologia dell'MHMC ha recentemente rivisto le sue linee guida cliniche per la gestione delle donne in sovrappeso/obese sulla base del bollettino di pratica ACOG del dicembre 2015 (2). A tutte le donne in sovrappeso/obese verrà offerta una consulenza nutrizionale all'inizio della gravidanza da un dietologo registrato del Dipartimento di nutrizione dell'MHMC con visite di follow-up secondo necessità per supportare il GWG nell'ambito delle linee guida dell'IOM. La terapia nutrizionale prenderà in considerazione il BMI materno pregravid, i fattori etnici, culturali e sociali nell'individuare un'alimentazione sana. La cartella clinica elettronica (EPIC) include un nomogramma grafico GWG e quindi il GWG sarà monitorato ad ogni visita. Tutti i soggetti saranno incoraggiati ad aumentare l'attività fisica per almeno 30 minuti al giorno (principalmente camminando). La gestione clinica come gli ultrasuoni per stimare la crescita fetale e la sorveglianza fetale si baseranno sulle raccomandazioni dell'ACOG. Il Lifestyle Coach continuerà a seguire solo i soggetti LIPP come descritto nella fase di mantenimento del progetto di ricerca.

Valutazioni metaboliche: le valutazioni metaboliche verranno eseguite al basale (3 mesi ? 2 settimane) dopo il parto. Le valutazioni di follow-up verranno eseguite dopo 4 (+/-2 settimane) e 12 mesi (+/-2 settimane), e successivamente ogni 6 mesi (+/-2 settimane) prima della gravidanza fino a un massimo di 24 mesi. Una volta che un soggetto ha la datazione della gravidanza e la vitalità confermata dall'ecografia, le valutazioni metaboliche continueranno a 12-16 e 32-36 settimane di gestazione.

Composizione corporea materna: le misurazioni antropometriche includeranno altezza, peso e circonferenze dei fianchi e della vita. Il grasso corporeo totale sarà misurato mediante pletismografia di tutto il corpo (Bod Pod; Cosmed, Roma, Italia). Useremo una costante di idratazione del 76% per la massa magra durante la gravidanza avanzata.

Dispendio energetico a riposo: Il tasso metabolico a riposo (RMR) sarà determinato dopo un digiuno notturno utilizzando il carrello metabolico Cosmed OMNIA (Cosmed, Roma Italia) con un sistema a baldacchino. Controlleremo la dieta fornendo un pasto bilanciato dal punto di vista energetico la sera prima del test dal CRU. I partecipanti si rilasseranno in una tranquilla stanza metabolica in condizioni di scarsa illuminazione per 30 minuti prima di ottenere una misurazione di 30 minuti del respiro espirato. Verrà stimato il metabolismo ossidativo e non ossidativo del glucosio e verranno prelevati campioni di urina prima e dopo la misurazione per calcolare il RQ non proteico (NPRQ). Questi dati saranno utilizzati insieme all'Obiettivo Specifico 2 e saranno correlati con il cambiamento della funzione mitocondriale durante la gravidanza.

Capacità di esercizio: verrà eseguito un test progressivo su tapis roulant al basale, 4 e 6 mesi in entrambi i gruppi. Il consumo di ossigeno (sistema Jaeger OxyCon Pro/Delta, Hoechberg, Germania), la frequenza cardiaca e le valutazioni dello sforzo percepito verranno eseguite come descritto in precedenza.

Sensibilità all'insulina e cellule beta Funzione: Verrà utilizzato un test di tolleranza al glucosio orale da 75 g (OGTT) per valutare la glicemia postprandiale, la sensibilità e la secrezione di insulina. Dopo un digiuno notturno, i campioni di sangue verranno prelevati a intervalli di 10 minuti per i primi 60 minuti e successivamente a intervalli di 20 minuti. I dati del C-peptide saranno analizzati utilizzando un approccio basato su modelli combinati per fornire i tassi di secrezione di insulina pre-epatica, la sensibilità all'insulina, l'indice di disposizione e correlare la cinetica dell'insulina e del Cpeptide (73). Il glucosio plasmatico sarà misurato utilizzando il metodo della glucosio ossidasi (YSI; Yellow Springs, OH).

L'insulina sarà dosata da RIA (Millipore, Billerica, MA). La diagnosi di GDM sarà effettuata utilizzando i criteri raccomandati dall'ACOG (74).

Risposte dell'asse enteroinsulare: campioni di plasma (con additivi appropriati) saranno ottenuti per misurare gli ormoni incretinici (peptide-1 simile al glucagone (GLP-1) e polipeptide insulinotropico glucosio-dipendente (GIP) e peptidi intestinali correlati alla sazietà (colecistochinina (CCK)) e il peptide YY (PYY). Le misurazioni saranno effettuate in condizioni statiche (a digiuno) e dinamiche (stimolate dal glucosio) (intervalli di 10 minuti fino a 1 ora).

Biomarcatori metabolici e infiammatori: Saranno ottenuti campioni di sangue a digiuno per misurare CBC, TSH, HbA1c, pannello lipidico e acidi grassi liberi totali (FFA). Le adipocitochine (adiponectina, leptina interleuchina-6, interleuchina-8, TNF-α e hsCRP) saranno misurate mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Tutti i campioni di ciascun soggetto verranno conservati a -80oC e analizzati nello stesso test al completamento per ridurre la variabilità.

Questionario sulla qualità della vita: il sondaggio sulla salute SF-36 verrà utilizzato al basale, a 4 e 12 mesi, e quindi a intervalli di 6 mesi fino alla gravidanza per valutare la qualità della vita correlata alla salute del soggetto. Questi dati forniranno una misura generica della salute fisica e mentale attraverso la valutazione del funzionamento fisico, del dolore corporeo, delle limitazioni dovute a problemi fisici, personali o emotivi e delle percezioni di benessere, energia/fatica e salute generale. Durante la gravidanza il questionario verrà somministrato a 12-16 e 32-36 settimane.

Misurazione della massa grassa nel neonato: abbiamo una vasta esperienza nella stima della composizione corporea nei neonati e siamo stati uno dei primi centri a procurarci un Pea Pod (densitometro pediatrico dell'aria), che è ospitato nella CRU accanto a Travaglio e parto e al postpartum unità.

Resistenza all'insulina alla nascita: Alla nascita otterremo sangue del cordone ombelicale per insulina e glucosio per stimare la resistenza all'insulina usando HOMA. Il profilo lipidico completo, la CRP e le adipochine IL-6 e leptina (un eccellente marcatore della massa grassa neonatale) saranno misurati nel sangue del cordone ombelicale come descritto sopra.

Risultati previsti, sfide e approcci alternativi:

L'outcome primario di questa proposta è la minore adiposità neonatale alla nascita nel gruppo LIPP rispetto a: 1) il gruppo di controllo e 2) con il primogenito del soggetto. Come esiti secondari prevediamo che prima di una gravidanza successiva, LIPP produrrà un miglioramento significativo (variazioni assolute e percentuali) nel peso materno e nella composizione corporea e, cosa più importante, migliorerà la sensibilità all'insulina, la funzione delle cellule beta, la risposta incretinica al glucosio, ai lipidi e all'infiammazione biomarcatori, rispetto al gruppo di controllo. Ci aspettiamo anche una ridotta insulino-resistenza, lipidi del cordone ombelicale e profili infiammatori nei bambini nati con LIPP rispetto ai controlli.

Il reclutamento è un problema ben noto per il successo dell'implementazione e del completamento delle prove di intervento sullo stile di vita. Tuttavia, data la nuova strategia per il reclutamento sopra descritta, il nostro accesso unico alla popolazione di pazienti e la nostra vasta esperienza nella ricerca metabolica in gravidanza, non prevediamo che il reclutamento presenti una sfida insormontabile. Recluteremo 200 soggetti nei primi 4 anni e completeremo tutte le valutazioni madre/bambino secondo la tempistica proposta. Se necessario recluteremo soggetti dalla Cleveland Clinic e dagli University Hospitals, entrambi affiliati alla Case Western Reserve University (CWRU). Le strategie di fidelizzazione includono il trasporto gratuito alle sessioni di allenamento, il servizio di assistenza all'infanzia gratuito durante le sessioni sullo stile di vita e le consultazioni con il Lifestyle Coach, app per telefoni cellulari per ridurre il carico del soggetto con l'inserimento dei dati, contatti telefonici regolari e incentivi finanziari, incluso un seggiolino per auto al momento del parto .

Il nostro team ha avuto un successo eccezionale nel trattenere le donne in gravidanza nei nostri precedenti studi di ricerca metabolica e di intervento sullo stile di vita nelle popolazioni in sovrappeso e obese (48,64). Nell'attuale proposta sono inoltre in atto ulteriori strategie per massimizzare la ritenzione e ridurre al minimo l'abbandono. Questi includono telefonate ed e-mail dal Lifestyle Coach per rivedere e rafforzare le capacità di problem solving e automonitoraggio come descritto per i partecipanti al Programma di prevenzione del diabete. Stabiliremo anche un sistema di amici in cui ogni partecipante diventa amico di un altro partecipante, i due amici possono preparare i pasti insieme, fare esercizio insieme, condividere problemi, ecc. Il sistema del compagno favorisce la sensazione che rimanere nello studio sia importante non solo per la salute dell'individuo ma anche per quella del compagno. Se i soggetti nel programma LIPP non raggiungono il loro obiettivo di perdita di peso target, attueremo una strategia di sostituzione del pasto utilizzando le risorse della cucina metabolica CRU/CTSC, con attenzione ai fabbisogni calorici e nutritivi della madre in funzione dell'allattamento al seno. Non tutti i partecipanti concepiranno. Poiché l'esito primario è l'adiposità neonatale, i soggetti che non diventano gravidi non saranno inclusi nell'analisi primaria ma saranno inclusi nelle analisi secondarie relative al miglioramento metabolico pregravid. Reclutando donne con una precedente gravidanza il rischio di infertilità è significativamente ridotto. Prevediamo che circa il 20% delle donne sperimenterà un aborto spontaneo, ma sarà loro permesso di continuare e riprendere la loro precedente partecipazione al LIPP o al gruppo di controllo. Prevediamo che circa il 25% dei soggetti abbandonerà prima di iniziare una gravidanza e un altro 15% potrebbe abbandonare durante la gravidanza. Arruolaremo 100 soggetti in ciascun braccio per tenere conto dell'improbabile evento del 40% di abbandono. Adottando una strategia ancora più rigorosa, riportiamo che il potere statistico è disponibile per un minimo di 50 soggetti per gruppo come scenario peggiore. Se la conservazione è in ritardo rispetto alle proiezioni, recluteremo ulteriori soggetti presso gli ospedali affiliati a MHMC e CWRU. Il personale della CRU assisterà nella raccolta del sangue del cordone ombelicale e della placenta al momento del parto e nell'esecuzione delle misurazioni del corpo di Pea Pod. In caso di malfunzionamento dell'apparecchiatura Pea Pod, stimeremo la composizione corporea utilizzando l'antropometria neonatale.

Sebbene i soggetti LIPP saranno incoraggiati a ritardare una seconda gravidanza fino a quando non si trovano nella fase di mantenimento del programma, escluderemo i soggetti LIPP solo se concepiscono durante la prima fase di perdita di peso di 4 mesi. Per i soggetti di controllo, l'esclusione si verificherà se un soggetto rimane incinta prima della visita di randomizzazione CRU postpartum di 3 mesi. L'uso del controllo delle nascite in questa fase è un criterio di inclusione. Non tutti i soggetti LIPP concepiranno in tempi simili dopo l'intervento di perdita di peso di 4 mesi. Non adegueremo il tempo tra le gravidanze tra i soggetti LIPP e di controllo. Utilizzeremo il LIPP e lo stato metabolico del soggetto di controllo (composizione corporea, sensibilità e risposta all'insulina, ecc.) all'ultima valutazione metabolica nella CRU prima di iniziare una gravidanza come stato pregravid o basale per la gravidanza successiva. Poiché questo è uno studio sulla gravidanza, verranno reclutate solo donne. Tuttavia, valuteremo l'effetto di LIPP sulla prole maschile e femminile, insieme e indipendentemente, in base al sesso.

Approccio statistico:

Le analisi primarie dell'Obiettivo Specifico 1a saranno confronti intent-to-treat dei gruppi LIPP e di controllo in relazione ai cambiamenti nella sensibilità materna all'insulina, al BMI e alla massa grassa. I confronti saranno eseguiti prima con t-test a due campioni a p=0.05. Se si riconosce uno squilibrio di fattori confondenti nei gruppi, i modelli di regressione lineare che includono differenze significative (ad es. GDM) verrà utilizzato per eseguire gli aggiustamenti delle covariate. Sulla base dei nostri studi di follow-up dopo il parto a 1 anno (62,63), avremo una potenza del 90% per rilevare un miglioramento assoluto o aggiustato per covariata nella sensibilità all'insulina del 30% e una potenza dell'80% per rilevare un miglioramento minimo di 25 % nel LIPP vs. Gruppo di controllo. Verranno riportati i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% (IC 95%) per le differenze assolute o aggiustate per covariata oi miglioramenti percentuali nella sensibilità all'insulina tra i gruppi. Stimiamo che la deviazione standard (DS) della variazione del BMI dalla randomizzazione fino alla successiva gravidanza sia di 5,1 kg/m2. Avremo il 90% di potenza per rilevare una differenza assoluta o aggiustata per covariata nel BMI di 2,6 kg/m2 e l'80% di potenza per rilevare una differenza di 2,26 kg/m2 e il 90% di potenza per rilevare una differenza assoluta o aggiustata per covariata nel grasso massa di 5,9 kg e 80% di potenza per rilevare una differenza di 5,1 kg tra i gruppi prima della seconda gravidanza. L'analisi primaria per l'Obiettivo Specifico 1b è un confronto intent-to-treat di neonati LIPP rispetto a quelli di controllo rispetto alla massa grassa alla nascita. Il confronto sarà eseguito utilizzando un t-test a due campioni a p=0.05. Verrà eseguita la regressione lineare, che includerà il peso (misure della composizione corporea) del primo figlio del soggetto come covariata. Qualora venga riconosciuto uno squilibrio di fattori confondenti (ad esempio l'età gestazionale) nei gruppi, verranno utilizzati modelli di regressione lineare per eseguire un aggiustamento della covariata. Sulla base dei nostri dati preliminari, stimiamo che la SD della massa grassa neonatale tra i gruppi LIPP e di controllo non sia superiore a 225 g. Con almeno 50 donne in ciascun gruppo (presupponendo un abbandono del 50%), il t-test o la regressione lineare avrà una potenza del 90% per rilevare una differenza assoluta o aggiustata per covariata di 146 g di massa grassa tra i gruppi. Abbiamo l'80% di potenza per rilevare una differenza assoluta o aggiustata per covariata di appena 126 g di massa grassa tra i gruppi. Verrà riportato il corrispondente IC al 95% per la differenza assoluta o aggiustata per covariata nella massa grassa neonatale tra i gruppi. Per le analisi secondarie, utilizzeremo lo stesso approccio statistico. Sulla base dei nostri dati preliminari, stimiamo che la SD del peso alla nascita sia di 700 g; con 50 neonati in ciascun gruppo avremo il 90% di potenza per rilevare una differenza assoluta o aggiustata per covariata di 455 g nel peso alla nascita e l'80% di potenza per rilevare una differenza di 393 g tra i gruppi. Ulteriori analisi secondarie includeranno le citochine del cordone ombelicale. I confronti saranno eseguiti utilizzando un t-test a due campioni ad un livello di significatività di p=0.05; tuttavia, se i dati non sono distribuiti normalmente, verranno utilizzati i test U di Mann-Whitney o le trasformazioni logaritmiche. I modelli di regressione lineare, inclusi i fattori di confondimento, verranno utilizzati per eseguire aggiustamenti delle covariate. Sulla base dei nostri dati pubblicati (80), stimiamo che le deviazioni standard di IL-6 e CRP del cordone ombelicale siano rispettivamente di 3,4 pg/ml e 7.900 ng/ml. Con 50 donne in ciascun gruppo, avremo il 90% di potenza per rilevare un miglioramento dei livelli di IL-6 e CRP rispettivamente del 50% e del 42% e l'80% per rilevare un miglioramento del 42% e del 36%.

Obiettivo specifico 2: Determinare gli effetti molecolari per cui l'intervento sullo stile di vita iniziato prima della gravidanza può migliorare l'ossidazione e l'accumulo di lipidi mitocondriali placentari.

Introduzione/Razionale: I nostri dati suggeriscono che nelle donne obese, un difetto mitocondriale nel tessuto placentare è presente all'inizio della gravidanza, inibendo la capacità placentare di ossidazione degli acidi grassi e deviando gli acidi grassi verso le vie di esterificazione e l'accumulo di lipidi, portando potenzialmente a una maggiore disponibilità di nutrienti per il feto e maggiore adiposità a termine. Il nostro gruppo ha dimostrato che altri processi mitocondriali, come il trasporto del colesterolo e la steroidogenesi, sono alterati nelle placente di donne obese e insulino-resistenti a termine. Il contenuto mitocondriale placentare (valutato dal mtDNA e dall'attività della citrato sintasi) non è influenzato dall'obesità materna e dall'insulino-resistenza a termine, suggerendo che i difetti osservati nella funzione sono dovuti a cambiamenti nell'attività mitocondriale, piuttosto che nel numero. Precedenti interventi dietetici avviati durante la gravidanza non erano in grado di alterare l'α-ossidazione placentare o la deposizione di grasso fetale, potenzialmente perché l'intervento era iniziato dopo che la funzione mitocondriale placentare era compromessa. Prevediamo che LIPP migliorerà l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali placentari, che sarà misurabile a termine e associata a minore esterificazione e accumulo di acidi grassi e massa grassa neonatale. L'ipotesi è che la ridotta sensibilità all'insulina e l'aumento dell'ambiente infiammatorio nelle madri obese compromettano l'α-ossidazione mitocondriale nella placenta in via di sviluppo. Sono i cambiamenti nel metabolismo placentare che iniziano all'inizio della gravidanza che portano ad un'alterata somministrazione di nutrienti e ad un aumento della deposizione di grasso fetale. Il nostro ragionamento si basa sulla necessità di comprendere come i cambiamenti nel metabolismo lipidico placentare mediano gli effetti del miglioramento del metabolismo pregravidico sull'adiposità neonatale. Ci aspettiamo che le placente delle donne obese nel programma LIPP mostrino una migliore ossidazione degli acidi grassi e una diminuzione dell'esterificazione e dell'accumulo di lipidi a termine. Inoltre, ci aspettiamo che questi cambiamenti siano correlati con una minore infiammazione materna e insulino-resistenza all'inizio della gravidanza e una minore adiposità neonatale a termine.

Risultati ed endpoint previsti: prevediamo che rispetto al gruppo di controllo, le placente delle donne in LIPP avranno: 1) aumento dell'α-ossidazione, 2) diminuzione dell'esterificazione degli acidi grassi, 3) contenuto lipidico inferiore, 4) aumento dell'attività del CPT1B mitocondriale, l'enzima limitante la velocità nell'α-ossidazione e un ACC di fosforo più elevato, che, quando fosforilato, produce meno malonil CoA, il principale regolatore inibitorio di CPT1B, e 5) nessuna differenza nel contenuto mitocondriale (misurato dal mtDNA e dall'attività della citrato sintasi) . Prevediamo anche che l'α-ossidazione mitocondriale e l'attività di CPT1B si correleranno negativamente con i marcatori di citochine infiammatorie sieriche materne all'inizio della gravidanza e l'insulino-resistenza e l'adiposità neonatale.

Disegno sperimentale: Raggiungeremo gli obiettivi dell'obiettivo specifico 2 misurando i cambiamenti nell'attività degli enzimi mitocondriali placentari e nel metabolismo lipidico nelle donne arruolate nei gruppi di controllo o LIPP descritti nell'obiettivo specifico 1. Il tessuto placentare sarà raccolto alla consegna da tutti i partecipanti allo studio e incorporato in paraffina o congelato a scatto in azoto liquido e conservato a -80°C per l'analisi molecolare. In un sottogruppo di donne che partoriscono con parto cesareo programmato (stimiamo ~ 30% dei nostri partecipanti o N = 15-18 / gruppo), raccoglieremo anche tessuto placentare fresco per i test dell'attività del metabolismo lipidico.

Metabolismo lipidico placentare: questi test sono ben consolidati nel laboratorio O'Tierney-Ginn. I saggi di ossidazione degli acidi grassi mitocondriali (FAO) e di esterificazione in lipidi totali saranno eseguiti in espianti di placenta come descritto in precedenza, con alcune modifiche. Gli espianti placentari appena isolati saranno incubati in presenza di 100 µM di palmitato freddo e 3H-palmitato (Moravek Radiochemicals) per 18 ore. Al termine del periodo di incubazione, i terreni saranno raccolti per quantificare il tasso di FAO mediante rilevazione di 3H2O utilizzando il metodo di equilibrio in fase vapore di Hughes. L'esterificazione in lipidi totali sarà determinata omogeneizzando gli espianti trattati in acetone HPLC e incubando con agitazione a temperatura ambiente per tutta la notte. Un'aliquota della sospensione lipidica dell'estratto di acetone verrà utilizzata per determinare il contenuto radioattivo mediante conteggio a scintillazione liquida. I tassi di ossidazione ed esterificazione saranno definiti come nmol palmitato/mg tessuto/ora.

Valutazione dei mitocondri placentari: I mitocondri saranno isolati dal tessuto placentare congelato come precedentemente descritto. I marcatori dell'attività di ossidazione lipidica (CPT1B) e di sintesi/esterificazione (fosfo-ACC) saranno misurati utilizzando kit disponibili in commercio (Cell Signaling, Abcam) in mitocondri isolati da tutti i campioni. I marcatori del contenuto mitocondriale (mtDNA e attività citrato sintasi) saranno misurati nell'intero tessuto placentare in tutti i campioni come precedentemente descritto.

Accumulo di lipidi placentari: il contenuto totale di lipidi placentari sarà misurato utilizzando il metodo Folch.

Sfide e alternative previste: 1) Useremo solo placente consegnate con parto cesareo programmato per i test di ossidazione ed esterificazione in vitro, per evitare cambiamenti pertinenti al travaglio. Nel nostro ospedale, il tasso di taglio cesareo per le donne obese è di circa il 40%. La nostra stima conservativa del 40-50% di abbandono seguito dal 30% dei soggetti che hanno partorito con taglio cesareo risulta in N=15-18/gruppo. Sulla base dei nostri dati preliminari, questo ci lascerà adeguatamente potenziati per rilevare differenze nel metabolismo lipidico placentare dovute a LIPP. Raccoglieremo campioni di placenta da tutti i partecipanti allo studio per i test dell'attività degli enzimi mitocondriali, fornendoci un'ulteriore valutazione dell'attività metabolica in un numero maggiore di partecipanti. 2) La capacità di ossidazione degli acidi grassi mitocondriali placentari può essere influenzata dal numero mitocondriale, dall'attività di fosforilazione ossidativa e dall'efficienza energetica (accoppiamento). La valutazione della capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale o dell'efficienza energetica richiede mitocondri appena isolati e/o cellule viventi che, per la nostra proposta, sarebbero eccessivamente ambiziosi e costosi considerando la natura imprevedibile della consegna e l'elevato numero di partecipanti. In alternativa, misureremo i marcatori del contenuto mitocondriale e gli enzimi chiave nel metabolismo lipidico mitocondriale in tutti i campioni placentari per valutare alcuni potenziali meccanismi alla base dei cambiamenti nell'ossidazione degli acidi grassi placentari. Inoltre, i campioni congelati raccolti da tutte le placente possono essere utilizzati per misurare gli enzimi coinvolti nel trasporto di elettroni (ad es. ATP sintasi) come marker della fosforilazione ossidativa mitocondriale.

Analisi statistica: l'obiettivo principale dell'obiettivo 2 è determinare l'effetto dell'intervento sullo stile di vita prima della gravidanza sull'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali placentari a termine. Ipotizziamo che l'α-ossidazione placentare sarà maggiore nel gruppo LIPP. Condurremo un'analisi intent-to-treat utilizzando due campioni t-test o test Wilcoxon rank-sum non parametrico per valutare le differenze tra i gruppi. L'analisi di regressione verrà utilizzata per valutare l'associazione dell'α-ossidazione placentare e dell'attività enzimatica con i livelli di citochine infiammatorie materne e l'insulino-resistenza all'inizio della gravidanza, insieme alla massa grassa neonatale con aggiustamento per età gestazionale e sesso. Per tutte le variabili verranno calcolate statistiche descrittive, come media, mediana e intervallo. L'analisi della potenza e della dimensione del campione basata sui nostri dati preliminari di ?-ossidazione mitocondriale nelle donne obese (38?14 nmol/mg/ora) ha mostrato che una dimensione del campione di N=18/gruppo raggiunge l'80% di potenza per rilevare una differenza del 25% tra gruppi utilizzando un test t a due campioni con un livello di significatività di 0,05.