Intervenção no estilo de vida na preparação para a gravidez (LIPP)

Objetivo Específico 1: Investigar o significado fisiológico da intervenção no estilo de vida em preparação para a gravidez (LIPP) no metabolismo materno e neonatal e na adiposidade.

Introdução/Justificativa: Nossos dados preliminares demonstram que a intervenção supervisionada no estilo de vida leva a perda significativa de peso, melhora da sensibilidade à insulina, tolerância à glicose e secreção de incretinas, juntamente com resultados cardiovasculares e de composição corporal mais saudáveis ​​em adultos com sobrepeso e obesos. Esperamos que o momento e a implementação da intervenção de estilo de vida proposta produzam benefícios de saúde semelhantes em mulheres com sobrepeso/obesas que planejam uma segunda gravidez e levem a uma maior sensibilidade à insulina, secreção reduzida de insulina e menos inflamação. Essas melhorias resultarão na prevenção do excesso de disponibilidade de nutrientes (glicose e lipídios) de contribuir para o excesso de crescimento/adiposidade fetal. A hipótese de trabalho para este objetivo é que, em contraste com GWG, a diminuição da sensibilidade à insulina pré-gravidez em mães obesas é responsável pela maior variação clínica no acúmulo de gordura na criança. Embora clinicamente prevejamos uma diminuição no peso e no IMC no grupo LIPP, a melhora na sensibilidade à insulina e no perfil metabólico são as principais medidas fisiológicas relacionadas ao desfecho primário da diminuição da adiposidade neonatal, e não à perda de peso per se.

A justificativa é que o momento ideal para implementar uma intervenção no estilo de vida que efetivamente melhore a saúde materna nos níveis fisiológico, celular e molecular e resulte em adiposidade ideal no bebê é antes da gravidez. As mulheres que perdem peso após o parto experimentam uma diminuição no peso neonatal ao nascer (principalmente tecido adiposo) na gravidez subsequente, enquanto as mulheres que ganham peso experimentam um aumento no peso neonatal ao nascer e na adiposidade. Nossa hipótese é que a condição metabólica materna pré-gravidez determina o ambiente in-utero obesogênico, que por sua vez afeta a programação placentária das vias mitocondriais e lipídicas (objetivo específico 2) e a composição corporal do bebê. Uma justificativa adicional é a necessidade de entender como a condição metabólica pré-gravidez melhorada afeta a função fisiológica e molecular materna. Prevemos que as mulheres obesas que concluírem o programa LIPP entrarão na gravidez com um metabolismo regulado pela insulina melhorado e resistência à insulina reduzida, facilitando assim um menor peso neonatal ao nascer e adiposidade. Vamos recrutar mães que deram à luz seu primeiro bebê no MHMC. Reconhecemos que essas mães representam um grupo demográfico que tem acesso limitado a instalações para exercícios ou sistemas de apoio familiar que facilitariam o tempo livre para exercícios. A fim de reduzir as barreiras à participação, conduziremos as sessões de exercícios nos Centros Recreativos Comunitários locais. Os Centros têm estruturas de acolhimento de crianças e nós suportamos os custos para que as participantes possam trazer os seus bebés às sessões do LIPP. Para aumentar ainda mais a participação e maximizar a retenção, forneceremos transporte de e para os Centros Recreativos. Suporte para transporte será solicitado ao Cleveland Mt. Fundação Sinai. Intervenção no estilo de vida Fase de perda de peso: O programa LIPP foi desenvolvido para promover a perda de peso de 5 a 10% do peso corporal. A fase de perda de peso de 4 meses consiste em treinamento de exercícios aeróbicos com dieta e aconselhamento comportamental para induzir a perda de peso, como foi alcançado com sucesso em estudos anteriores. Inicialmente, o exercício supervisionado será prescrito a 55-60% da FCmáx e gradualmente aumentado para que, após 1-2 semanas, os sujeitos estejam se exercitando a 75-85% da FCmáx (~65-70% VO2máx). O exercício supervisionado consistirá em caminhada/corrida em esteira e ciclismo estacionário, 3 dias/semana, 60 min/sessão (ou seja, 500 kcal/sessão). As mulheres usarão monitores de frequência cardíaca (FC) (Polar Electro, Woodbury, NY) durante cada sessão de exercício para que tenham feedback visual de sua meta personalizada de frequência cardíaca. Os participantes serão aconselhados a reduzir a ingestão calórica em aproximadamente 500 kcal/d para apoiar suas metas de perda de peso. A dieta recomendada fornecerá ~ 55% de calorias como carboidratos, 25% como gordura e 20% como proteína. Os participantes serão instruídos a consumir carboidratos complexos e evitar açúcares simples. As necessidades calóricas específicas serão estimadas por calorimetria indireta e um fator de correção de atividade física sedentária (x1,3). A ingestão de energia será estimada usando o aplicativo de diário fotográfico de alimentos, Meal Snap. A fotografia digital fornece uma excelente estimativa da ingestão de energia (67). Os participantes que não possuem um smartphone terão um fornecido por meio do suporte da Cleveland Foundation.

Registros cobrindo um período de dieta de 72 horas serão compartilhados com a equipe de pesquisa para determinação da ingestão de calorias e nutrientes. O Meal Snap possui um banco de dados de alimentos com mais de 350.000 itens. No entanto, algumas refeições não estarão neste banco de dados, portanto, nossos Lifestyle Coaches inserirão todos os alimentos consumidos em nosso banco de dados de dieta (NDSR, Minneapolis, MN) para facilitar a análise de calorias e ingestão de macro/micronutrientes. Os sujeitos irão gerar fotos de antes e depois da refeição para estimar a quantidade de comida que foi ingerida. Os dados serão obtidos na linha de base e em intervalos de 2 semanas durante o período inicial de perda de peso supervisionado de 16 semanas.

Intervenção no Estilo de Vida - Controle/Manutenção de Peso: O programa de controle de peso pré-gravidez (fase 2A, 2B e 2C) é projetado para facilitar metas personalizadas de perda de peso usando comportamentos de estilo de vida que incluem exercícios, dieta e modificação comportamental, e é baseado em parte em o teste Look AHEAD. A intervenção inclui um conceito de caixa de ferramentas para ajudar a atingir as metas de perda de peso. Os Lifestyle Coaches fornecerão instruções personalizadas sobre atividade física/exercício - 10.000 passos/dia, e os participantes usarão o FitBit Flex (Fitbit.com) para rastrear a contagem de passos e o tempo de exercício. Durante a primeira fase de manutenção de peso (2A) as mulheres irão frequentar 2 sessões de grupo supervisionadas/semana. Essas sessões incluem exercícios estruturados (por exemplo, Zumba, jazzercise, andar de carrinho), revisão de registros fotográficos dietéticos, onde as refeições foram feitas (em casa ou fora; gravadas em um aplicativo de smartphone) e aconselhamento comportamental (com seu Lifestyle Coach). Os participantes serão encorajados a comer 1.200-1.500 kcal/d (~55% de carboidratos, 25% de gordura, 20% de proteína) se estiverem abaixo de 113 kg, ou 1.500-1.800 kcal/d se >113 kg. Os dados dietéticos serão analisados ​​em intervalos de 4 semanas durante o período de manutenção do peso. É importante ressaltar que, para minimizar a sobrecarga do assunto e maximizar a retenção e aquisição de dados, o Lifestyle Coach rastreará a ingestão de calorias usando o diário fotográfico do participante. Estratégias comportamentais para motivar decisões de estilo de vida saudável incluirão: automonitoramento (comida, atividade e peso, usando os recursos on-line FitBit), estabelecimento de metas (passos/dia, perda de peso), controle de estímulos (ou seja, alimentação social, fast food, sentar vs. em pé), resolução de problemas (ter lanches disponíveis, exercícios em casa) e prevenção de recaídas (ou seja, feriados, álcool, fast food, doces, alimentos problemáticos, compulsão alimentar). Após 4 meses e a perda de peso desejada, os indivíduos passam para a Fase 2B. Durante esta fase, os indivíduos mantêm uma meta de exercício de 10.000 passos/dia, mas serão obrigados a participar de apenas 1 sessão supervisionada/semana. Se um indivíduo não conseguir manter a perda de peso, definida como ganho de peso de 3% do peso corporal atual, os participantes retornarão à Fase 2A para um controle de peso mais supervisionado. Alternativamente, se a perda de peso for mantida após 3 meses, os indivíduos irão progredir para a Fase 2C até a próxima gravidez. A Fase 2C não consiste em sessões de exercícios supervisionados. No entanto, o sujeito e o Lifestyle Coach conversarão semanalmente por telefone para revisar o progresso, incluindo dados de exercícios e dieta da Fitbit. Os dados sugerem que os programas de controle de peso fornecidos por telefone são comparáveis ​​aos programas fornecidos clinicamente. Durante os atendimentos os participantes serão orientados a continuar se exercitando na intensidade e duração prescritas durante a Fase 2B. Eles receberão alimentos específicos para o idioma e livros de registro de exercícios. Estes serão usados ​​para orientar a ingestão de calorias e fornecerão outro registro de conformidade. As participantes randomizadas para o grupo Controle receberão informações sobre dieta pós-gravidez/perda de peso do nutricionista da CRU, diferentemente do nutricionista do LIPP (HB) para diminuir a contaminação cruzada entre os grupos. Controle de peso durante a gravidez: todos os grupos LIPP e cuidados/controle usuais serão acompanhados por seu obstetra principal. O departamento de obstetrícia/ginecologia do MHMC revisou recentemente suas diretrizes clínicas para o tratamento de mulheres com sobrepeso/obesas com base no boletim de prática ACOG de dezembro de 2015 (2). Todas as mulheres com sobrepeso/obesas receberão aconselhamento nutricional no início da gravidez por um nutricionista registrado do Departamento de Nutrição do MHMC com visitas de acompanhamento conforme necessário para apoiar o GWG dentro das diretrizes do IOM. A terapia nutricional considerará o IMC materno pré-gravídico, fatores étnicos, culturais e sociais na individualização da alimentação saudável. O registro eletrônico de saúde (EPIC) inclui um nomograma GWG gráfico e, portanto, o GWG será monitorado a cada visita. Todos os indivíduos serão encorajados a aumentar a atividade física por pelo menos 30 minutos/dia (principalmente caminhada). O manejo clínico, como ultrassonografias para estimar o crescimento fetal e vigilância fetal, será baseado nas recomendações do ACOG. O Lifestyle Coach continuará a acompanhar apenas os sujeitos do LIPP, conforme descrito na fase de manutenção do projeto de pesquisa.

Avaliações metabólicas: As avaliações metabólicas serão realizadas na linha de base (3 meses - 2 semanas) pós-parto. As avaliações de acompanhamento serão realizadas após 4 (+/-2 semanas) e 12 meses (+/-2 semanas) e depois a cada 6 meses (+/-2 semanas) antes da gravidez até um máximo de 24 meses. Uma vez que um indivíduo tenha datação de gravidez e viabilidade confirmada por ultrassom, as avaliações metabólicas continuarão em 12-16 e 32-36 semanas de gestação.

Composição Corporal Materna: As medidas antropométricas incluirão altura, peso e circunferências do quadril e da cintura. A gordura corporal total será medida por pletismografia de corpo inteiro (Bod Pod; Cosmed, Roma, Itália). Usaremos uma constante de hidratação de 76% para massa isenta de gordura durante o final da gravidez.

Despesa de Energia em Repouso: A Taxa Metabólica em Repouso (RMR) será determinada após um jejum noturno usando o carrinho metabólico Cosmed OMNIA (Cosmed, Roma, Itália) com um sistema de dossel. Faremos o controle da dieta fornecendo uma refeição padronizada com equilíbrio energético na noite anterior ao teste da CRU. Os participantes relaxarão em uma sala metabólica silenciosa com pouca luz por 30 minutos antes de obter uma medição de 30 minutos da respiração expirada. O metabolismo oxidativo e não oxidativo da glicose será estimado e amostras de urina serão obtidas antes e após a medida para cálculo do QR não proteico (NPRQ). Esses dados serão usados ​​em conjunto com o Objetivo Específico 2 e serão correlacionados com a alteração da função mitocondrial durante a gravidez.

Capacidade de Exercício: Um teste de esteira incremental gradual será realizado na linha de base, 4 e 6 meses em ambos os grupos. O consumo de oxigênio (Jaeger OxyCon Pro/Delta System, Hoechberg, Alemanha), frequência cardíaca e avaliação da percepção de esforço serão realizados conforme descrito anteriormente.

Sensibilidade à Insulina e Células ? Função: Um teste oral de tolerância à glicose (OGTT) de 75 g será usado para avaliar a glicemia pós-prandial, sensibilidade e secreção de insulina. Após um jejum noturno, amostras de sangue serão coletadas em intervalos de 10 minutos durante os primeiros 60 minutos e em intervalos de 20 minutos a partir de então. Os dados do peptídeo C serão analisados ​​usando uma abordagem de modelo combinado para fornecer taxas de secreção de insulina pré-hepática, sensibilidade à insulina, índice de disposição e relacionar insulina e cinética do peptídeo C (73). A glicose plasmática será medida usando o método da glicose oxidase (YSI; Yellow Springs, OH).

A insulina será analisada por RIA (Millipore, Billerica, MA). O diagnóstico de GDM será feito usando critérios recomendados pelo ACOG (74).

Respostas do Eixo Enteroinsular: Amostras de plasma (com aditivos apropriados) serão obtidas para medir os hormônios incretina (peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP-1) e polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP) e peptídeos intestinais relacionados à saciedade (colecistocinina (CCK) , e peptídeo YY (PYY). As medições serão feitas em condições estáticas (jejum) e dinâmicas (estimuladas com glicose) (intervalos de 10 min até 1 hora).

Biomarcadores metabólicos e inflamatórios: Amostras de sangue em jejum serão obtidas para medir CBC, TSH, HbA1c, painel lipídico e ácidos graxos livres totais (FFA). As adipocitocinas (adiponectina, leptina, interleucina-6, interleucina-8, TNF-? e hsCRP) serão dosadas por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todas as amostras de cada indivíduo serão armazenadas a -80oC e executadas no mesmo ensaio na conclusão para diminuir a variabilidade.

Questionário de qualidade de vida: A pesquisa de saúde SF-36 será usada na linha de base, 4 e 12 meses e depois em intervalos de 6 meses até a gravidez para avaliar a qualidade de vida relacionada à saúde do sujeito. Esses dados fornecerão uma medida genérica de saúde física e mental por meio da avaliação do funcionamento físico, dor corporal, limitações devido a problemas físicos, pessoais ou emocionais e bem-estar, energia/fadiga e percepções gerais de saúde. Durante a gravidez, o questionário será aplicado às 12-16 e 32-36 semanas.

Medição da massa gorda no lactente: Temos uma vasta experiência em estimar a composição corporal em recém-nascidos e fomos um dos primeiros centros a adquirir um Pea Pod (densitometria aérea pediátrica), que fica na CRU ao lado do trabalho de parto e pós-parto unidade.

Resistência à insulina no nascimento: Ao nascimento, obteremos sangue do cordão umbilical para insulina e glicose para estimar a resistência à insulina usando HOMA. Perfil lipídico completo, PCR e as adipocinas IL-6 e leptina (um excelente marcador de massa gorda neonatal) serão medidos no sangue do cordão umbilical conforme descrito acima.

Resultados antecipados, desafios e abordagens alternativas:

A medida de resultado primário desta proposta é menor adiposidade neonatal ao nascer no grupo LIPP em relação a: 1) o grupo de controle e 2) com o primogênito do sujeito. Como resultados secundários, prevemos que, antes de uma gravidez subsequente, o LIPP produzirá uma melhora significativa (alterações absolutas e percentuais) no peso materno e na composição corporal e, mais importante, sensibilidade à insulina, função das células beta, resposta incretina à glicose, lipídios e inflamação biomarcadores, em comparação com o grupo Controle. Também esperamos redução da resistência à insulina, lipídios do cordão e perfis inflamatórios em bebês nascidos de LIPP em comparação com os controles.

O recrutamento é um problema bem reconhecido para a implementação e conclusão bem-sucedidas de testes de intervenção no estilo de vida. No entanto, dada a nova estratégia de recrutamento detalhada acima, nosso acesso exclusivo à população de pacientes e nossa ampla experiência em pesquisa metabólica na gravidez, não prevemos que o recrutamento represente um desafio intransponível. Recrutaremos 200 indivíduos nos primeiros 4 anos e completaremos todas as avaliações mãe/bebê de acordo com o cronograma proposto. Se necessário, recrutaremos indivíduos da Cleveland Clinic e University Hospitals, ambos afiliados à Case Western Reserve University (CWRU). As estratégias de retenção incluem transporte gratuito para as sessões de exercícios, serviço gratuito de creche durante as sessões de estilo de vida e consultas com o Lifestyle Coach, aplicativos de celular para reduzir a sobrecarga do sujeito com entrada de dados, contatos telefônicos regulares e incentivos financeiros, incluindo uma cadeirinha infantil no momento do parto .

Nossa equipe teve um sucesso notável na retenção de mulheres grávidas em nossas pesquisas metabólicas anteriores e estudos de intervenção no estilo de vida em populações com sobrepeso e obesidade (48,64). Na proposta atual, estratégias adicionais também estão em vigor para maximizar a retenção e minimizar o abandono. Isso inclui telefonemas e e-mails do Lifestyle Coach para revisar e reforçar a resolução de problemas e as habilidades de automonitoramento, conforme descrito para os participantes do Programa de Prevenção do Diabetes. Também estabeleceremos um sistema de amigos onde cada participante se torna amigo de outro participante, os dois amigos podem preparar refeições juntos, fazer exercícios juntos, compartilhar problemas, etc. O sistema de amigos promove a sensação de que permanecer no estudo é importante não apenas para a saúde do indivíduo, mas também para o amigo. Se os participantes do programa LIPP não atingirem sua meta de perda de peso, implementaremos uma estratégia de substituição de refeições usando os recursos da cozinha metabólica do CRU/CTSC, com atenção às necessidades calóricas e nutricionais da mãe, dependendo da amamentação. Nem todos os participantes irão conceber. Uma vez que o desfecho primário é a adiposidade neonatal, os indivíduos que não engravidam não serão incluídos na análise primária, mas serão incluídos nas análises secundárias relacionadas à melhora metabólica pré-gravidez. Ao recrutar mulheres com uma gravidez anterior, o risco de infertilidade é significativamente reduzido. Prevemos que aproximadamente 20% das mulheres sofrerão um aborto espontâneo, mas elas poderão continuar e retomar sua participação anterior no LIPP ou no grupo de controle. Prevemos que aproximadamente 25% das participantes desistirão antes de engravidar e outros 15% podem desistir durante a gravidez. Vamos inscrever 100 indivíduos em cada braço para contabilizar o evento improvável de abandono de 40%. Adotando uma estratégia ainda mais rigorosa, relatamos que o poder estatístico está disponível para apenas 50 indivíduos por grupo como o pior cenário. Se a retenção ficar aquém das projeções, recrutaremos indivíduos adicionais nos hospitais afiliados ao MHMC e CWRU. A equipe da CRU ajudará na coleta de sangue do cordão umbilical e da placenta no parto e na realização das medidas corporais da Vagem de Ervilha. Se houver um mau funcionamento do equipamento Pea Pod, estimaremos a composição corporal usando a antropometria neonatal.

Embora as mulheres com LIPP sejam encorajadas a adiar uma segunda gravidez até que estejam na fase de manutenção do programa, excluiremos as mulheres com LIPP apenas se conceberem durante os primeiros 4 meses da fase de perda de peso. Para os indivíduos de controle, a exclusão ocorrerá se um indivíduo engravidar antes da visita de randomização da CRU de 3 meses pós-parto. O uso de anticoncepcional nessa fase é critério de inclusão. Nem todos os indivíduos LIPP conceberão em momentos semelhantes após a intervenção de perda de peso de 4 meses. Não ajustaremos o tempo entre as gestações entre as disciplinas LIPP e Controle. Usaremos o LIPP e o estado metabólico do sujeito de controle (composição corporal, sensibilidade e resposta à insulina, etc.) na última avaliação metabólica na CRU antes de engravidar como seu estado pré-gravidez ou linha de base para a gravidez subsequente. Como este é um estudo de gravidez, apenas mulheres serão recrutadas. No entanto, avaliaremos o efeito do LIPP na prole masculina e feminina, em conjunto e independentemente, com base no sexo.

Abordagem Estatística:

As análises primárias do Objetivo Específico 1a serão comparações de intenção de tratar dos grupos LIPP e Controle em relação a mudanças na sensibilidade materna à insulina, IMC e massa gorda. As comparações serão realizadas primeiro com testes t de duas amostras em p=0,05. Caso algum desequilíbrio de fatores de confusão nos grupos seja reconhecido, modelos de regressão linear que incluem diferenças significativas (por exemplo, GDM) será usado para realizar ajustes de covariáveis. Com base em nossos estudos de acompanhamento pós-parto de 1 ano (62,63), teremos 90% de poder para detectar uma melhora absoluta ou ajustada por covariável na sensibilidade à insulina de 30% e um poder de 80% para detectar uma melhora tão pequena quanto 25 % no LIPP vs. Grupo de controle. Intervalos de confiança correspondentes de 95% (95% CI) para diferenças absolutas ou ajustadas por covariáveis ​​ou melhorias percentuais na sensibilidade à insulina entre os grupos serão relatados. Estimamos o desvio padrão (DP) da mudança no IMC desde a randomização até a gravidez subseqüente em 5,1 kg/m2. Teremos 90% de poder para detectar uma diferença absoluta ou ajustada por covariável no IMC de 2,6 kg/m2 e 80% de poder para detectar uma diferença de 2,26 kg/m2 e 90% de poder para detectar uma diferença absoluta ou ajustada por covariável na gordura massa de 5,9 kg e poder de 80% para detectar uma diferença de 5,1 kg entre os grupos antes da segunda gravidez. A análise primária para o Objetivo Específico 1b é uma comparação de intenção de tratar de recém-nascidos LIPP versus controle em relação à massa gorda no nascimento. A comparação será realizada usando um teste t de duas amostras em p = 0,05. Será realizada regressão linear, que incluirá o peso (medidas da composição corporal) do primeiro filho do sujeito como covariável. Caso algum desequilíbrio de fatores de confusão (por exemplo, idade gestacional) nos grupos seja reconhecido, modelos de regressão linear serão usados ​​para realizar um ajuste de covariável. Com base em nossos dados preliminares, estimamos que o SD da massa gorda neonatal entre os grupos LIPP e Controle não seja superior a 225g. Com pelo menos 50 mulheres em cada grupo (assumindo uma desistência de 50%), o teste t ou regressão linear terá 90% de poder para detectar uma diferença absoluta ou ajustada por covariável de 146 g de massa gorda entre os grupos. Temos 80% de poder para detectar uma diferença absoluta ou ajustada por covariável tão pequena quanto 126 g de massa gorda entre os grupos. O IC de 95% correspondente para a diferença absoluta ou ajustada por covariável na massa de gordura neonatal entre os grupos será relatado. Para análises secundárias, usaremos a mesma abordagem estatística. Com base em nossos dados preliminares, estimamos que o DP do peso ao nascer seja de 700 g; com 50 recém-nascidos em cada grupo, teremos 90% de poder para detectar uma diferença absoluta ou ajustada por covariável de 455 g no peso ao nascer e 80% de poder para detectar uma diferença de 393 g entre os grupos. Análises secundárias adicionais incluirão citocinas do cordão umbilical. As comparações serão realizadas usando um teste t de duas amostras em um nível de significância de p = 0,05; no entanto, testes Mann-Whitney U ou transformações de log serão empregados se os dados não forem normalmente distribuídos. Modelos de regressão linear, incluindo fatores de confusão, serão usados ​​para realizar ajustes de covariáveis. Com base em nossos dados publicados (80), estimamos os desvios padrão de IL-6 e PCR do cordão umbilical em 3,4 pg/ml e 7.900 ng/ml, respectivamente. Com 50 mulheres em cada grupo, teremos 90% de poder para detectar uma melhora nos níveis de IL-6 e PCR de 50% e 42%, e 80% de poder para detectar uma melhora de 42% e 36%, respectivamente.

Objetivo específico 2: Determinar os efeitos moleculares pelos quais a intervenção no estilo de vida iniciada antes da gravidez pode melhorar a oxidação e o acúmulo de lipídios mitocondriais na placenta.

Introdução/Justificativa: Nossos dados sugerem que em mulheres obesas, um defeito mitocondrial no tecido placentário está presente no início da gravidez, inibindo a capacidade placentária de oxidação de ácidos graxos e desviando os ácidos graxos para vias de esterificação e acúmulo de lipídios, levando potencialmente a um aumento da disponibilidade de nutrientes para o feto e maior adiposidade a termo. Nosso grupo demonstrou que outros processos mitocondriais, como transporte de colesterol e esteroidogênese, estão prejudicados em placentas de mulheres obesas e resistentes à insulina a termo. O conteúdo mitocondrial placentário (avaliado por mtDNA e atividade da citrato sintase) não é afetado pela obesidade materna e resistência à insulina a termo, sugerindo que os defeitos observados na função são devidos a mudanças na atividade mitocondrial, e não no número. As intervenções dietéticas anteriores iniciadas durante a gravidez não foram capazes de alterar a ?-oxidação placentária ou a deposição de gordura fetal, possivelmente porque a intervenção foi iniciada após a função mitocondrial da placenta ter sido prejudicada. Prevemos que o LIPP melhorará a oxidação mitocondrial de ácidos graxos da placenta, que será mensurável a termo e associada a menor esterificação e acúmulo de ácidos graxos e massa gorda neonatal. A hipótese é que a diminuição da sensibilidade à insulina e o aumento do ambiente inflamatório em mães obesas prejudicam a ?-oxidação mitocondrial na placenta em desenvolvimento. São as mudanças no metabolismo placentário que começam no início da gravidez que levam à alteração na distribuição de nutrientes e ao aumento da deposição de gordura fetal. Nosso raciocínio é baseado na necessidade de entender como as mudanças no metabolismo lipídico da placenta medeiam os efeitos do metabolismo pré-gravídico melhorado na adiposidade neonatal. Esperamos que as placentas de mulheres obesas no programa LIPP mostrem melhor oxidação de ácidos graxos e diminuição da esterificação e acúmulo de lipídios a termo. Além disso, esperamos que essas alterações se correlacionem com menor inflamação materna e resistência à insulina no início da gravidez e menor adiposidade neonatal a termo.

Resultados e pontos finais antecipados: Prevemos que, em comparação com o grupo de controle, as placentas de mulheres em LIPP terão: 1) aumento da ?-oxidação, 2) diminuição da esterificação de ácidos graxos, 3) menor teor de lipídios, 4) aumento da atividade de CPT1B mitocondrial, a enzima limitante da velocidade na ?-oxidação e maior fósforo ACC, que, quando fosforilado, produz menos malonil CoA, o principal regulador inibitório do CPT1B, e 5) nenhuma diferença no conteúdo mitocondrial (conforme medido pelo mtDNA e pela atividade da citrato sintase) . Também prevemos que a ?-oxidação mitocondrial e a atividade de CPT1B se correlacionarão negativamente com marcadores de citocinas inflamatórias séricas maternas no início da gravidez, resistência à insulina e adiposidade neonatal.

Projeto Experimental: Nós atingiremos os objetivos do Objetivo Específico 2 medindo as mudanças na atividade da enzima mitocondrial placentária e no metabolismo lipídico em mulheres inscritas nos grupos Controle ou LIPP descritos no Objetivo Específico 1. O tecido placentário será coletado no momento do parto de todos os participantes do estudo e embebidos em parafina ou congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80oC para análise molecular. Em um subconjunto de mulheres que tiveram parto por cesariana programada (estimamos ~30% de nossas participantes ou N=15-18/grupo), também coletaremos tecido fresco da placenta para ensaios de atividade do metabolismo lipídico.

Metabolismo lipídico placentário: Esses ensaios estão bem estabelecidos no laboratório O'Tierney-Ginn. Ensaios de oxidação de ácidos graxos mitocondriais (FAO) e esterificação em lipídios totais serão realizados em explantes placentários conforme descrito anteriormente, com algumas modificações. Explantes de placenta recém-isolados serão incubados na presença de 100 ?M de palmitato frio e 3H-palmitato (Moravek Radiochemicals) por 18 horas. Ao final do período de incubação, serão coletados meios para quantificar a taxa de FAO por detecção de 3H2O usando o método de equilíbrio da fase vapor de Hughes. A esterificação em lipídios totais será determinada pela homogeneização dos explantes tratados em acetona grau HPLC e incubação com agitação à temperatura ambiente durante a noite. Uma alíquota da suspensão lipídica do extrato de acetona será utilizada para determinar o conteúdo radioativo por contagem de cintilação líquida. As taxas de oxidação e esterificação serão definidas como nmol palmitato/mg tecido/h.

Avaliação das mitocôndrias placentárias: As mitocôndrias serão isoladas do tecido placentário congelado conforme descrito anteriormente. Marcadores de atividade de oxidação lipídica (CPT1B) e síntese/esterificação (fosfo-ACC) serão medidos usando kits comercialmente disponíveis (Cell Signaling, Abcam) em mitocôndrias isoladas de todas as amostras. Marcadores de conteúdo mitocondrial (mtDNA e atividade da citrato sintase) serão medidos em todo o tecido placentário em todas as amostras conforme descrito anteriormente.

Acúmulo de lipídios placentários: O conteúdo lipídico placentário total será medido usando o método de Folch.

Desafios e Alternativas Antecipadas: 1) Usaremos apenas placentas provenientes de cesariana programada para ensaios de oxidação e esterificação in vitro, para evitar alterações pertinentes ao trabalho de parto. Em nosso hospital, a taxa de cesariana para mulheres obesas é de aproximadamente 40%. Nossa estimativa conservadora de abandono de 40-50% seguido por 30% de partos por cesariana resulta em N=15-18/grupo. Com base em nossos dados preliminares, isso nos deixará adequadamente capacitados para detectar diferenças no metabolismo lipídico da placenta devido ao LIPP. Coletaremos amostras da placenta de todos os participantes do estudo para ensaios de atividade enzimática mitocondrial, fornecendo-nos uma avaliação adicional da atividade metabólica em um número maior de participantes. 2) A capacidade de oxidação de ácidos graxos mitocondriais placentários pode ser afetada pelo número mitocondrial, atividade de fosforilação oxidativa e eficiência energética (acoplamento). A avaliação da capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial ou eficiência energética requer mitocôndrias recém isoladas e/ou células vivas que, para nossa proposta, seriam excessivamente ambiciosas e dispendiosas considerando a natureza imprevisível da entrega e o grande número de participantes. Alternativamente, mediremos marcadores de conteúdo mitocondrial e enzimas-chave no metabolismo lipídico mitocondrial em todas as amostras da placenta para avaliar alguns mecanismos potenciais subjacentes às alterações na oxidação de ácidos graxos da placenta. Além disso, amostras congeladas coletadas de todas as placentas podem ser usadas para medir enzimas envolvidas no transporte de elétrons (por exemplo, ATP sintase) como um marcador de fosforilação oxidativa mitocondrial.

Análise Estatística: O objetivo principal do Objetivo 2 é determinar o efeito da intervenção no estilo de vida antes da gravidez na oxidação de ácidos graxos mitocondriais da placenta a termo. Nossa hipótese é que a ?-oxidação placentária será maior no grupo LIPP. Conduziremos uma análise de intenção de tratar usando o teste t de duas amostras ou o teste não paramétrico Wilcoxon rank-sum para avaliar as diferenças entre os grupos. A análise de regressão será usada para avaliar a associação da ?-oxidação placentária e atividade enzimática com os níveis de citocinas inflamatórias maternas e resistência à insulina no início da gravidez, juntamente com a massa de gordura neonatal com ajuste para idade gestacional e sexo. Estatísticas descritivas, como média, mediana e intervalo, serão calculadas para todas as variáveis. A análise do poder e do tamanho da amostra com base em nossos dados preliminares de oxidação ? grupos usando um teste t de duas amostras com um nível de significância de 0,05.