Misurazione dell'impatto dell'integrazione alimentare con un nuovo prodotto da forno sul microbiota intestinale e sul metabolismo del colesterolo

I primi risultati dei test in vitro del progetto PreBIOil hanno delineato la capacità di una farina di olive di modulare la popolazione microbica dell'intestino umano in maniera paragonabile a quella dell'inulina riconosciuta come polisaccaride con capacità prebiotica. Sulla base di questi risultati, e di altri presenti in letteratura, è stato formulato il prodotto da forno PreBIOil. Il prodotto contiene, farina di olive, grano saraceno, piselli e castagne.

L'obiettivo generale dello studio è valutare se l'introduzione nella dieta di un prodotto da forno preparato con farina di olive, impastata con farina di grano saraceno, piselli e castagne possa modificare il profilo del microbiota intestinale e del colesterolo plasmatico, in particolare LDL. Lo studio è impostato come integrazione alimentare, in doppio cieco, randomizzato, parallelo con il gruppo di controllo, in cui verrà confrontato il seguente prodotto:

i) un nuovo prodotto da forno progettato dallo studio PreBIOil (test); ii) un controllo isoenergetico del prodotto da forno (controllo).

Descrizione dell'alimento integrato nella sperimentazione Il prodotto in prova è un nuovo prodotto da forno formulato con un impasto di farine di olive, grano saraceno, piselli e castagne e ha l'aspetto di un biscotto salato.

Ai partecipanti sarà richiesto di consumare giornalmente circa 90 grammi di test o prodotto di controllo. Le quantità esatte di ciascun lotto di prodotto saranno determinate a seguito della valutazione delle caratteristiche nutrizionali del prodotto finito al fine di fornire lo stesso apporto calorico con i due prodotti.

Digeribilità, fermentescibilità e modulazione del microbiota Il grano saraceno è considerato un non cereale che oltre a contenere fibre, sali minerali e vitamine, come B2 e B6, rappresenta anche una fonte di composti antiossidanti per il contenuto di flavonoidi.

La farina di piselli contiene componenti importanti per la dieta umana (amido, proteine ​​e altri nutrienti). I benefici per la salute associati al consumo di piselli derivano principalmente dalla concentrazione e dalle proprietà di amido, proteine, fibre, vitamine, minerali e sostanze fitochimiche. La fibra contenuta nel tegumento e nelle pareti cellulari del cotiledone contribuisce alla funzione gastrointestinale. Il contenuto di amido nella farina di piselli è caratterizzato da un indice glicemico più basso. Le proteine ​​del pisello possono produrre peptidi con attività antiossidante. Il contenuto vitaminico e minerale dei piselli può svolgere un ruolo importante nella prevenzione delle malattie da carenza, in particolare quelle relative alle carenze di selenio e folati. I piselli contengono una varietà di sostanze fitochimiche. Questi includono polifenoli che possono avere attività antiossidante e antitumorale, saponine che sono presenti attività ipocolesterolemica e antitumorale e oligosaccaridi del galattosio che possono esercitare benefici prebiotici nell'intestino crasso.

I componenti nutrizionali della farina di castagne sono costituiti da carboidrati, proteine ​​e grassi nella composizione tale da fornire un valore energetico di circa 350-400 kcal/100 g. Le castagne sono state votate per avere un effetto positivo sul metabolismo dei batteri intestinali e sono una fonte di acidi grassi a catena lunga C18:1 e C18:2 e vitamine (vitamina E). L'eventuale presenza di polifenoli è limitata alle bucce esterne, generalmente separate dal frutto durante la produzione della farina. La farina proveniente dalla pasta di olive non è descritta nella letteratura scientifica per proprietà nutritive specifiche per l'alimentazione umana. Tuttavia le olive sono parte integrante della dieta mediterranea in cui vengono consumate come olive da tavola e olio d'oliva. Il frutto dell'oliva contiene il 50% di acqua, il 22% di grassi, circa il 19% di carboidrati e circa il 2% di proteine; il contenuto di polifenoli varia nell'intervallo 1-3%. Le olive vengono consumate o come olio di oliva o olive da mensa. Le olive sono caratterizzate da un forte amaro, causato per lo più dall'oleuropeina. L'oleuropeina può raggiungere i 140 mg/g di peso secco nelle olive acerbe e diminuisce e man mano che il frutto matura le olive da tavola vengono trattate per attenuare il gusto amaro attraverso processi come la macerazione soda e la fermentazione in salamoia. Tuttavia nel processo di addolcimento l'amaro ha perso alcuni importanti composti presenti nelle olive come i polifenoli e la fibra. Non ci sono evidenze sulla capacità dei polifenoli dell'olio extravergine di oliva di ridurre il rischio di malattie cardiovascolari, ma gran parte dei possibili effetti dei componenti dell'oliva da soli o in sinergia con i polifenoli sono ancora inesplorati. Inoltre gran parte della frazione idrosolubile contenuta nelle olive, tra cui le fibre ei polifenoli dalle comprovate attività benefiche sulla salute dell'uomo, non viene rimossa nel processo di produzione dell'olio. È stato dimostrato che alcune frazioni fenoliche come i secoiridoidi sono scarsamente assorbite dalla mucosa intestinale e sono quindi disponibili per la microflora del colon. In sostanza l'olio nella sua interezza avrebbe le maggiori potenzialità in quanto alimento in grado di modulare beneficamente la composizione e l'attività dei microrganismi simbiotici dell'intestino umano, come osservato sperimentalmente per altri tipi di frutta.

Mediante simulazione in vitro della fermentazione del colon è stato osservato che la pasta di olive, anche dopo cottura a 180°C per 30', è in grado di modulare il microbiota intestinale umano con effetto prebiotico o di indurre un aumento significativo dei bifidobatteri. Tale simulazione in vitro è stata effettuata mediante incubazione per 24 ore in un sistema di fermentazione discontinua con controllo del pH e della temperatura, previa inoculazione con le feci ottenute da cinque individui sani. L'analisi dei polifenoli totali (principali antiossidanti presenti nel prodotto in esame) presenti nella farina di olive, nella miscela della farina e nel prodotto in esame ha rilevato una perdita di polifenoli totali, a seguito della cottura in forno pari al 40%.

Risultati clinici I risultati clinici hanno dimostrato che il consumo giornaliero di 100 g di grano saraceno sotto forma di farina ha determinato l'aumento del rapporto HDL/colesterolo e il miglioramento della tolleranza al glucosio e più recentemente è stato osservato che il consumo di biscotti a base di grano saraceno ha ridotto la livello sierico di un marcatore di infiammazione, la mieloperossidasi (MPO) oltre ad una riduzione del colesterolo totale con una migliore capacità vitale polmonare. Una recente meta-analisi di diversi studi di intervento sulla dieta umana con l'integrazione di legumi, inclusi i piselli, ha mostrato la loro capacità di diminuire i livelli sierici di colesterolo LDL.

Sono stati condotti studi di intervento sulla dieta con oli di oliva, sottoprodotti della lavorazione delle olive e prodotti a base di olive su volontari sani e soggetti con vari gradi di rischio cardiovascolare. Di questi studi sono state indicate le dosi giornaliere di polifenoli totali introdotti (da pochi mg/die a 30 mg/die, fino a 100 mg/die) a seconda del tipo di olio di oliva e anche l'arricchimento con estratti. Questi interventi hanno avuto in molti casi una durata di circa un mese, e la maggior parte degli studi ha misurato gli effetti delle alterazioni antiossidanti e antinfiammatorie del sistema circolatorio, insieme ai valori dei lipidi plasmatici, e di altri parametri legati allo stress ossidativo. In particolare nello studio "EUROLIVE", su un ampio campione di individui sani, è stato osservato che i fenoli dell'olio di oliva erano in grado di proteggere i lipidi del sangue dall'ossidazione, aumentare la concentrazione di colesterolo HDL e il rapporto tra glutatione ridotto e ossidato, invece nessuna variazione dell'F2-isoprostano.

Nel 2011 l'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) ha approvato l'affermazione secondo cui i polifenoli dell'olio d'oliva, in particolare l'idrossitirosolo, proteggono le LDL dall'ossidazione, a una dose maggiore o uguale a 5 mg/kg/giorno. Altri studi hanno anche dimostrato che i polifenoli dell'olio d'oliva sono correlati alla riduzione della CRP, alla ridotta espressione genica aterogenica nelle cellule del sangue e alla diminuzione della pressione sanguigna. Sebbene esistano evidenze sulla capacità dei polifenoli dell'olio di oliva di ridurre il rischio di malattie cardiovascolari, gran parte dei possibili effetti dei componenti dell'oliva da soli o in sinergia sono ancora inesplorati. Inoltre, gran parte delle fibre e dei polifenoli contenuti nell'oliva non viene estratta nel processo di estrazione dell'olio ed eliminata come sottoprodotto.

Razionale dello studio La farina di grano saraceno apporta fibre e flavonoidi, la farina di piselli contiene carboidrati a basso indice glicemico, proteine ​​ed è anche fonte di antiossidanti, la farina di castagne apporta sostanze prebiotiche e vitamine. La farina di oliva è il frutto dell'oliva sia con i suoi componenti idrosolubili (es. Fibre e polifenoli) e nella frazione solubile di acidi grassi polinsaturi e monoinsaturi, tocoferoli e carotenoidi che solo parzialmente passano all'extravergine di oliva. Questi componenti sono concepiti principalmente come componenti dell'olio extravergine di oliva e scientificamente hanno dimostrato di contribuire al miglioramento del metabolismo lipidico e del quadro lipidico plasmatico, alla salute del cuore e alla protezione dallo stress ossidativo.

Sulla base degli studi clinici e sperimentali disponibili, è stato suggerito che il consumo di un prodotto da forno costituito da una miscela di farine di pasta di olive, grano saraceno, piselli e castagne può avere effetti positivi sui biomarcatori lipidici plasmatici e sul microbiota intestinale (ad esempio, un aumento di bifidobatteri) in partecipanti adulti con contenuto plasmatico di colesterolo a livelli medio-alti anche se non ancora patologici.

Dichiarazione di dichiarazione di conformità Questo studio sarà condotto in conformità con il protocollo e in conformità con la buona pratica clinica (GCP), come descritto in ICH GCP per il 1996, il codice dei regolamenti federali (CFR) degli Stati Uniti e la dichiarazione di Helsinki. Con la firma del presente protocollo, il ricercatore si impegna a rispettare tali requisiti.

Obiettivi dello studio

L'obiettivo generale dello studio è valutare se l'introduzione nella dieta di un nuovo prodotto da forno contenente un impasto di farine di pasta di olive, grano saraceno, piselli, castagne sia in grado di modificare:

Obiettivi primari:

1. Il profilo del microbiota fecale;
2. Livelli plasmatici di colesterolo totale, LDL, rapporto/LDL totale e HDL;
3. I livelli plasmatici dei trigliceridi;
4. Apolipoproteina ApoA-I, ApoB e Lp (a).

Obiettivi secondari:

1. Gli indici antropometrici 2 I metaboliti secondari dei polifenoli nei biofluidi umani 3. I profili dei metaboliti nel plasma e nelle urine valutati mediante analisi di spettrometria di massa (MS); 4. I livelli di glicemia e di insulina a digiuno; 5. Proteina C-reattiva (PRC); 6. Proteina C-reattiva ad alta sensibilità (hsPRC); 7. isoprostano F2 urinario; 8. LDL ossidate nel plasma.

Presentazione disegno sperimentale I volontari partecipanti saranno individuati e reclutati presso un ambulatorio della Casa di Cura Eremo di Arco (TN). I partecipanti saranno informati sulle finalità e le modalità dello studio e saranno preselezionati in base a criteri di inclusione/esclusione. Il partecipante, firmerà il consenso informato ed entrerà in studio dopo la visita al T-1, eseguita presso la parte ambulatoriale della Casa di Cura Eremo di Arco (TN) dove verrà eseguito uno stato di salute clinico e biochimico. Per consentire un corretto monitoraggio delle abitudini alimentari, il partecipante idoneo, dopo la prima visita compilerà un diario alimentare.

Se i soggetti saranno eleggibili per lo studio in base a tutti i criteri di inclusione ed esclusione, saranno randomizzati per ricevere il placebo o l'integrazione attiva alla visita T0.

L'esame clinico e la raccolta del sangue e delle urine verranno effettuati dopo un digiuno di circa 10 ore all'inizio del periodo di avviamento (visita T-1). Durante le visite T0, T1 verranno eseguiti esami clinici, prelievi ematici, raccolta delle feci e delle urine. Il diario alimentare aggiuntivo (4 giorni consecutivi) verrà compilato alle visite T0 e prima del T1. Eventi avversi, assunzione di farmaci e integratori verranno registrati dai partecipanti in un apposito diario.

Ai partecipanti inclusi nello studio verrà inoltre chiesto di compilare una valutazione sensoriale di ciascun alimento offerto in cieco, al primo assaggio e al termine di 8 settimane di integrazione per ciascun prodotto

Procedura di studio Reclutamento dei partecipanti I partecipanti saranno individuati e reclutati presso un ambulatorio della Casa di cura Eremo di Arco (TN) I partecipanti saranno informati sulle finalità e le modalità dello studio e saranno preselezionati in base a criteri di inclusione/esclusione . Se idoneo, il partecipante firmerà il consenso informato ed entrerà in studio con una visita al T-1, che verrà eseguita durante uno stato di salute clinico e biochimico. I soggetti che saranno eleggibili per lo studio in base a tutti i criteri di inclusione/esclusione, saranno inclusi nello studio e randomizzati a ricevere la prima integrazione alimentare (test o controllo) per visitare T0 (due settimane dopo dal run-in ).

Supplementazione

Dopo la valutazione dell'idoneità, i partecipanti saranno randomizzati per ricevere l'integrazione con il prodotto da forno con il test o il prodotto di controllo:

Le singole dosi giornaliere saranno confezionate in confezioni codificate da un gruppo qualificato. La supplementazione durerà otto settimane, in doppio cieco, in parallelo. con uno dei due prodotti (attribuito alla randomizzazione).

Follow up Il progetto consisterà in un periodo di otto settimane di supplementazione, esami clinici e la raccolta di sangue e urina sarà effettuata dopo un digiuno notturno (escluso il consumo di acqua) di circa 10 ore per visitare T-1. Verranno effettuati gli esami clinici, il prelievo del sangue, la raccolta delle feci e le analisi delle urine al T0, T1: T0 è il giorno della prima integrazione, T1 saranno otto settimane dopo l'inizio del trattamento. Il diario alimentare sarà compilato per la visita T-1 e distribuito prima delle visite T0 e T1 per la raccolta dati delle visite T0 e T1.

Valutazione clinica Elettrocardiogramma. Un ECG verrà eseguito allo screening (T-1). I tracciati ECG saranno rivisti e interpretati dalla parte ambulatoriale della Casa di Cura Eremo di Arco.

La pressione sanguigna sarà misurata secondo le linee guida per l'ipertensione ISH / WHO 2004 Indici antropometrici Peso e altezza saranno misurati su una scala standard. Le misure saranno effettuate su soggetti privi di scarpe, cappotti o indumenti pesanti. L'indice di massa corporea, BMI, è calcolato in kg/m2.

La circonferenza della vita (ombelicale) sarà misurata in un modo determinato dal National Institutes of Health, National Heart, Lung e Blood Institute. Viene calcolato il rapporto tra la circonferenza della vita e il rapporto dell'anca (WHR).

Questionari Tutte le informazioni saranno raccolte e registrate in questionari validati, compresa l'identificazione personale, la storia medica e le informazioni sui fattori di rischio per le malattie cardiovascolari, l'uso di farmaci, l'attività fisica e le abitudini alimentari. Inoltre, ogni partecipante scriverà un diario alimentare di quattro giorni.

Ai partecipanti inclusi nello studio verrà inoltre chiesto di compilare una valutazione sensoriale di ciascun alimento offerto nella prima degustazione alla cieca e alla fine delle 8 settimane di integrazione.

Prelievo di sangue e raccolta delle urine Il sangue (≤ 30 ml) verrà prelevato da una vena periferica, dopo 10 ore di digiuno. Verranno raccolte le urine delle 24 h, il volume misurato e il campione verrà conservato a -80°C.

Raccolta di campioni fecali I campioni fecali saranno processati entro 12 ore dalla raccolta del campione. Aliquote di ciascun campione fecale saranno congelate direttamente a -80°C per l'analisi del profilo metabolomico.

Esami di laboratorio a cura del laboratorio analisi della Casa di Cura Eremo di Arco I campioni di sangue verranno centrifugati secondo le prescrizioni degli esami da eseguire subito dopo il prelievo. Il plasma o il siero verranno separati, in parte immediatamente testati e la restante frazione conservata a -80°C.

Colesterolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi e glucosio saranno valutati con metodo enzimatico. Il colesterolo LDL sarà misurato analiticamente con metodo enzimatico.

I livelli di insulina saranno valutati mediante elettrochemioluminescenza. L'emocromo e la conta piastrinica saranno valutati con metodo impedenziometrico. La proteina C-reattiva (CRP) sarà misurata mediante saggio turbidimetrico. La proteina C-reattiva ad alta sensibilità (hsPCR) sarà misurata mediante saggio turbidimetrico.

L'apolipoproteina AI (ApoA-I), l'ApoB e la Lp (a) sono state determinate mediante immunoturbidimetria.

Il test per la verifica dell'assenza di glicosuria verrà effettuato misurando la concentrazione di glucosio nelle urine.

Test di laboratorio della Fondazione Edmund Mach [EMF] Profilo metabolomico urinario e plasmatico. Gli F2-isoprostani saranno misurati nelle urine come misura dello stress ossidativo, mediante apposito kit EIA, previa purificazione mediante cromatografia su fase solida (colonne SepPack).

L'analisi delle LDL ossidate nel plasma sarà condotta con l'ausilio del kit ELISA.

I campioni di urina e di sangue (plasma e siero) saranno sottoposti sia ad analisi di metabolomica mirata (UPLC-MS/MS per i composti non volatili e GC-MS/MS per i composti volatili) che ad analisi di metabolomica non mirata (ULPC -Q -TOF-MS e Nano -FTMS-Q-TOF non volatile e GC-TOF per i composti volatili). Per i profili dei metaboliti plasmatici mirati, verrà utilizzato il kit P180 Biocrates AbsoluteIDQ ® basato su MS, generando dati quantitativi precisi su 180 metaboliti umani legati al rischio di diabete. Inoltre, specifiche analisi mirate saranno applicate al profilo lipidico degli acidi biliari sierici, degli acidi grassi a catena corta (acidi grassi a catena corta, SCFA) e alla quantificazione dei metaboliti dei polifenoli di origine microbica nei biofluidi (comprese le feci) con UPLC/ QQQ-MS / MS.

Analisi del microbiota fecale. I cambiamenti nel microbiota fecale di specifiche popolazioni batteriche saranno valutati utilizzando il metodo dell'ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH).

Anche i cambiamenti nel microbiota fecale saranno valutati utilizzando un approccio di metagenomica utilizzando il pirosequenziamento 454. In breve, dopo la raccolta dei campioni di feci (n = 128, 2 campioni di feci a diversi tempi T0, T1 da 64 soggetti prima e dopo il consumo di ogni test alimentare e placebo) estrarrà il DNA genomico batterico utilizzando il kit SPIN FastDNA (MPbio ) specifico per le feci. Utilizzando primers specifici per il gene batterico 16S rRNA (regione ipervariabile V1-V3) sarà effettuato mediante amplificazione PCR e quindi sottoponendo il V1-V3 amplificato a 454 pyrosequencing.

Utilizzerà il GS FLX Titanium Chemistry con adattatori Multiplex Identifier (MID) per ottenere sequenze di lunghezza 600 bp che verranno analizzate confrontando il database di 16S rRNA filogenetico, pubblicamente disponibile, tramite la pipeline QIIME che consente l'assegnazione al livello di genere umano microbiota intestinale. Verranno prodotte complessivamente circa 20.000 sequenze per ogni campione fecale. Come controllo di qualità e analisi dell'ecologia microbica, verrà utilizzata una statistica multivariata per correlare i cambiamenti nella composizione del microbiota fecale in seguito al consumo di test alimentari o placebo.

Randomizzazione in cieco I partecipanti verranno assegnati in modo casuale ma equamente distribuiti per sesso ed età a uno dei due trattamenti: test prodotto da forno o prodotto di controllo anche utilizzando software specifico. I ricercatori clinici, gli investigatori e il personale di laboratorio saranno all'oscuro della randomizzazione.

Trattamento L'integrazione verrà introdotta nella dieta quotidiana attraverso il consumo di un prodotto da forno (test) per un consumo giornaliero di 90 grammi di prodotto contenente farina di olive, di grano saraceno, di piselli, di castagne. Il cibo fornirà un apporto calorico di controllo analogico. I prodotti in studio (test o controllo) saranno forniti in confezioni che saranno etichettate nella lingua locale con il numero di codice dello studio. il nome del produttore, il numero di pazienti, il numero di visite di studio. I prodotti saranno distribuiti ai partecipanti dalla visita T0.

Durata dello studio e pianificazione Dopo che sarà valutata l'idoneità, i partecipanti saranno randomizzati in due gruppi (test del prodotto o controllo) che seguiranno 8 settimane di integrazione alimentare.

La durata complessiva dello studio, compreso il periodo di avvio (run-in) e il trattamento, sarà di 10 settimane.

Il reclutamento inizierà successivamente ed entro tre mesi dall'approvazione da parte del Comitato Etico.

Il rodaggio inizierà entro due settimane dalla prima visita (T-1). I soggetti saranno reclutati per un periodo di 10 mesi e lo studio sarà completato entro 12 mesi dal momento del primo reclutamento.

Criteri per l'interruzione dello studio In conformità con la Dichiarazione di Helsinki, gli standard ICH di buona pratica clinica e il "Food and Drug Administration (FDA) Regulations" degli Stati Uniti, una persona ha il diritto di ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento e a qualsiasi titolo, fatte salve le future cure mediche da parte del medico o dell'ente. Gli investigatori hanno anche il diritto di ritirare i soggetti dello studio (vedi sotto). Nel caso in cui una persona (o un rappresentante legalmente autorizzato) decida di andare in pensione, sarà fatto ogni sforzo per completare e riportare le osservazioni nel miglior modo possibile. Una valutazione complessiva finale dovrebbe essere effettuata al momento del ritiro del soggetto dove il motivo del ritiro deve essere registrato e in ogni caso dovrebbe essere fatto un tentativo di eseguire una valutazione di follow-up.

I soggetti possono essere rimossi dallo studio per i seguenti motivi:

Violazione del protocollo da parte dello sperimentatore Compliance non significativa da parte del soggetto Il rifiuto del soggetto di continuare il trattamento o commenti Tossicità inaccettabile Decisione del ricercatore che la chiusura è nel migliore interesse medico del soggetto Evento poco chiaro di malattia o complicanze Uso di farmaci concomitanti che sono incompatibili con lo studio. Gravidanza Abuso di alcol o droghe Coloro che interrompono o si ritirano dallo studio non verranno sostituiti.

Procedura per la cessazione

Se un individuo si interrompe prima del completamento dello studio, verranno registrati il ​​motivo e la data limite. La data dell'ultima dose di cibo nello studio dovrebbe essere registrata. In caso di risoluzione anticipata, devono essere eseguite le seguenti procedure:

Test clinici (sistolica e diastolica, frequenza cardiaca, peso e altezza per calcolare BMI e circonferenza vita e fianchi).

Prelievo di sangue e feci e raccolta delle urine. Un questionario sulla frequenza alimentare (settimanale). Nel caso in cui il soggetto non possa tornare per la visita di controllo, gli investigatori dovranno tentare di contattare telefonicamente la persona per tracciare eventuali eventi avversi.

Se una persona ritira il consenso a ricevere cibo in studio, sarai incoraggiato a rimanere nello studio senza ricevere cure per la raccolta dei dati sulla sicurezza.

Le procedure di affidabilità del prodotto in studio I prodotti (test o controllo) verranno forniti in confezioni etichettate nella lingua locale con il numero di codice dello studio, il numero di codice del sito, il nome del produttore, il numero di partecipanti, il numero di visite dello studio, numero di lotto, istruzioni per la conservazione e date di scadenza. I prodotti saranno distribuiti ai partecipanti dalla visita T0.

Codici di randomizzazione I codici di randomizzazione per sesso ed età, per ogni partecipante, saranno conservati in busta chiusa dal gruppo qualificato di Qualità Sensoriale (QS del Dipartimento di Nutrizione e Qualità degli Alimenti del Centro Ricerca e Innovazione della Fondazione Edmund Mach).

Controllo della fonte dei dati Tutti i dati raccolti durante lo studio saranno ottenuti da fonti primarie e saranno registrati in documenti scritti e cartelle cliniche elettroniche come soggetto. I risultati degli esami clinici, di laboratorio e dell'ECG saranno registrati nella cartella clinica elettronica del soggetto. Nessun dato verrà inserito direttamente nella “scheda segnalazione casi” (CRF), senza essere trasferito dalla fonte primaria, quale documentazione cartacea o elettronica.

Terapia farmacologica concomitante Qualsiasi farmaco assunto dal soggetto entro un mese prima dell'inizio dello studio e/o somministrato durante lo studio sarà considerato come terapia concomitante. Tale trattamento deve essere documentato nell'apposita pagina del CRF e nelle cartelle cliniche dei soggetti. Eventuali modifiche alla terapia concomitante durante lo studio devono essere chiaramente registrate e il motivo della modifica deve essere documentato.

Verrà inviata una lettera al medico di ciascun partecipante, specificando quali sono i trattamenti concomitanti incompatibili con lo studio. Durante lo studio non sarà consentito l'uso dei seguenti farmaci: anticoagulanti, antipertensivi, ipolipemizzanti, beta-bloccanti, corticosteroidi sistemici, neurolettici, antibiotici, lassativi, integratori vitaminici, antiossidanti e minerali, fibre alimentari, prebiotici (es. inulina, oligofruttosio) e probiotici. Pertanto se il soggetto necessita di terapie farmacologiche incompatibili con lo studio, il soggetto viene avvisato dal medico curante di terminare lo studio e darne comunicazione al responsabile dello studio e seguendo le procedure per l'interruzione anticipata.

Compliance Rating Per valutare la compliance alla supplementazione, verranno misurati i fenoli urinari nei soggetti che verranno integrati con test alimentari a T0, T1. Inoltre, tutti gli imballaggi non utilizzati o vuoti alla fine di ogni settimana verranno restituiti agli sperimentatori.

Metodi Sicurezza Non ci sono stati problemi di sicurezza durante studi precedenti relativi al consumo di prodotti a base di olive, grano saraceno, farina di piselli, farina di castagne.

Lo studio sarà monitorato dal personale medico e paramedico della Casa di Cura Eremo di Arco. Gli eventi avversi verranno comunque registrati durante lo studio. Valori di laboratorio anormali che inducono segni o sintomi clinici o richiedono un intervento terapeutico saranno tempestivamente comunicati al soggetto, qualora il soggetto abbia espresso esplicitamente la volontà di ricevere tale comunicazione sotto forma di consenso informato. Il soggetto sarà libero di ritirarsi anticipatamente dallo studio qualora necessiti di un intervento terapeutico non compatibile con lo studio, o qualora si verifichino eventi avversi che comportino un cambiamento nei criteri di inclusione di tale soggetto nello studio. Il soggetto sarà comunque libero di ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento, nel caso in cui lo studio sia dovuto a disagio a seguito della procedura di interruzione anticipata.

Analisi statistica Le caratteristiche di base sono elencate per tipo di integrazione: le variabili continue sono espresse come media +/- deviazione standard o mediane con range interquartile e come percentuale per le variabili categoriali. I dati con una distribuzione asimmetrica seguiranno un'elaborazione del registro prima dell'analisi. Le differenze tra i due supplementi saranno valutate con metodi statistici univariati e multivariati. Il mezzo prima e dopo l'intervento sarà confrontato con il General Linear Model (ANOVA) per misure ripetute o per dati appaiati. Eseguirai regressioni lineari semplici e multiple per determinare le relazioni tra variabili indipendenti; inoltre eseguiremo il test per valutare le differenze di compliance rilevate nelle tipologie di integrazione. I risultati sono espressi come media +/- SEM e le differenze saranno considerate significative quando P <0,05. I dati con una distribuzione asimmetrica seguiranno un'elaborazione del registro prima dell'analisi.

L'analisi principale sarà basata su un confronto delle differenze nei livelli medi dopo il consumo del prodotto in esame e dopo il consumo del controllo. Verranno inoltre misurate le differenze tra i valori medi alla fine di ogni supplementazione (T1) rispetto al relativo valore medio basale (T0).

Le differenze di tempo tra i bracci di trattamento saranno valutate mediante analisi della varianza per misure ripetute. Il livello di significatività sarà considerato <0,05 in due code.

La dimensione del campione per ogni integrazione è stata determinata a 32 per rilevare una diminuzione del colesterolo LDL nel plasma pari a circa 15,44 mg/dl con una deviazione standard di 14,28 mg/dl utilizzando l'equazione Snedecor e Cochran con α pari a 0,05 e 1 -β pari a 0,9 (Dell et al., 2002). Secondo questa formula il numero minimo di soggetti da iscrivere è pari a 28. Tenendo conto di possibili abbandoni, 32 persone per l'integrazione con il prodotto di prova e 32 persone per l'integrazione con il prodotto di controllo per un totale di 64 soggetti volontari in questo studio.

La valutazione viene effettuata sulla base dell'abbondanza della diminuzione del colesterolo LDL nel plasma, sulla base delle misure (media e deviazione standard) del colesterolo LDL riportate in uno studio parallelo pubblicato sull'European Journal of Nutrition. Il parametro colesterolo LDL, oltre ad essere riconosciuto un effetto sulla salute umana, è più restrittivo e richiede tempi di osservazione più lunghi dell'entità della modificazione della microflora intestinale.

Accesso diretto a dati/documenti di origine Le autorità di regolamentazione potrebbero voler effettuare controlli sulla ricerca clinica per valutare la conformità ai principi della GCP. Le autorità di regolamentazione potrebbero anche voler condurre un'ispezione (durante il processo o dopo il suo completamento). In caso di sopralluogo richiesto da un'autorità regolatoria e/o dal Comitato Etico per le Sperimentazioni Cliniche c/o APSS Trento, il ricercatore deve acconsentire a fornire l'accesso, alle autorità regolatorie, alla documentazione relativa allo studio.

Gestione dei dati e registrazioni La fonte dei dati e della documentazione è definita come il primo luogo in cui i dati vengono registrati. Eventuali documenti originali e non devono essere conservati e resi disponibili nello stesso luogo. Il ricercatore deve conservare i documenti originali per ogni persona che partecipa allo studio.

I dati raccolti sul CRF durante il processo saranno documentati in forma anonima, e saranno identificati da numeri o simboli. Se in circostanze eccezionali è necessario, per ragioni di sicurezza o di regolamento, identificare la persona, OlioCRU Ltd e il ricercatore sono tenuti a mantenere riservate tali informazioni.

Tutti i dati inseriti nella CRF devono essere leggibili e registrati con inchiostro nero. Se si desidera una correzione, questa va effettuata cancellando la voce con una sola riga e inserendo le informazioni corrette accanto all'elemento stesso. La correzione deve essere siglata e datata dall'investigatore o da una persona qualificata designata.