测量膳食补充剂对肠道微生物群和胆固醇代谢的影响

PreBIOil 项目的体外测试的第一个结果描述了橄榄粉调节人体肠道微生物种群的能力，其方式与被认为具有益生元能力的多糖菊糖相当。 基于这些结果以及文献中的其他结果，烘焙产品 PreBIOil 已被配制。 该产品包含橄榄粉、荞麦粉、豌豆粉和栗子粉。

该研究的总体目标是评估在饮食中引入由橄榄粉、荞麦粉、豌豆粉和栗子粉混合制成的烘焙产品是否可以改变肠道微生物群和血浆胆固醇（尤其是低密度脂蛋白）的特征。 该研究设置为膳食补充剂、双盲、随机、与对照组平行，其中将比较以下产品：

i) 一种新的烘焙产品设计研究 PreBIOil（测试）； ii) 烘焙产品控制等能（控制）。

试验添加食品说明 试验品为橄榄、荞麦、豌豆、栗子粉混合配制而成的新型烘焙食品，外观为咸饼干。

参与者将被要求每天消耗约 90 克测试或控制产品。 每个产品批次的确切数量将在评估成品的营养特性后确定，以便为两种产品提供相同的卡路里摄入量。

微生物群的消化率、发酵性和调节性 荞麦被认为是一种非谷物食品，除了含有纤维、矿物质和维生素（例如 B2 和 B6）外，由于含有类黄酮，它还是抗氧化化合物的来源。

豌豆粉含有人类饮食的重要成分（淀粉、蛋白质和其他营养素）。 与食用豌豆相关的健康益处主要来自淀粉、蛋白质、纤维、维生素、矿物质和植物化学物质的浓度和特性。 包含在外皮和子叶细胞壁中的纤维有助于胃肠功能。 豌豆粉中淀粉含量的特点是血糖指数较低。 豌豆中的蛋白质可以产生具有抗氧化活性的肽。 豌豆的维生素和矿物质含量可以在预防缺乏症方面发挥重要作用，特别是那些与硒和叶酸缺乏症有关的疾病。 豌豆含有多种植物化学物质。 这些包括可能具有抗氧化和抗癌作用的多酚、具有低胆固醇血症和抗癌活性的皂苷，以及可以在大肠中发挥益生元益处的半乳糖低聚糖。

栗粉的营养成分由碳水化合物、蛋白质和脂肪组成，可提供约 350-400 kcal / 100 g 的能量值。 栗子被认为对肠道细菌的新陈代谢有积极影响，并且是长链脂肪酸 C18:1 和 C18:2 以及维生素（维生素 E）的来源。 多酚的可能存在仅限于外皮，通常在面粉生产过程中与水果分离。 科学文献中没有描述来自橄榄酱的面粉对人类饮食的特定营养特性。 然而，橄榄是地中海饮食中不可或缺的一部分，它们作为食用橄榄和橄榄油被食用。 橄榄果含有50%的水分、22%的脂肪、约19%的碳水化合物和约2%的蛋白质；多酚含量在 1-3% 范围内变化。 橄榄被食用或作为橄榄油或食用橄榄。 橄榄的特点是强烈的苦味，主要由 dall'oleuropein 引起。 橄榄苦苷在未成熟的橄榄中可达到 140 毫克/克干重，并随着果实成熟而减少，通过浸渍苏打和盐水发酵等工艺处理食用橄榄以减轻苦味。 然而，在加甜的过程中，苦味失去了橄榄中存在的一些重要化合物，如多酚和纤维。 没有证据表明特级初榨橄榄油多酚具有降低心血管疾病风险的能力，但橄榄成分单独或与多酚协同作用的很大一部分可能影响仍未得到探索。 此外，橄榄中含有的大部分水溶性部分，其中纤维和多酚类物质对人体健康具有已证明的有益活性，但在石油生产过程中并未被去除。 有证据表明，一些酚类成分如开环环烯醚萜很难被肠粘膜吸收，然后可用于结肠微生物群落。 从本质上讲，油作为一种食物具有最大的潜力，可以有益地调节共生人类肠道微生物的组成和活性，正如对其他类型水果的实验观察到的那样。

通过结肠发酵的体外模拟，观察到橄榄糊即使在 180°C 下烘烤 30 分钟后，也能够以益生元作用调节人体肠道微生物群或诱导双歧杆菌显着增加。 这种体外模拟是通过在控制 pH 值和温度的分批发酵系统中孵育 24 小时，然后接种来自五个健康个体的粪便来进行的。 对存在于橄榄粉、面粉混合物和测试产品中的总多酚（测试产品中存在的主要抗氧化剂）的分析确实检测到总多酚的损失，这是烘烤的结果，相当于 40%。

临床结果 临床结果表明，每天食用 100 克面粉形式的荞麦已经决定了高密度脂蛋白/胆固醇比率的增加和葡萄糖耐量的改善，最近观察到食用荞麦制成的饼干降低了炎症标志物髓过氧化物酶 (MPO) 的血清水平以及总胆固醇的降低以及更好的肺活量。 最近对补充豆类（包括豌豆）的人类饮食进行的几项干预研究的荟萃分析表明，它们能够降低血清低密度脂蛋白胆固醇水平。

对健康志愿者和具有不同程度心血管风险的受试者进行了关于橄榄油、橄榄加工副产品和橄榄制品的饮食干预研究。 在这些研究中，已指出引入的总多酚的每日剂量（从几毫克/天到 30 毫克/天，高达 100 毫克/天）取决于橄榄油的类型以及提取物的浓度。 在许多情况下，这些干预措施的持续时间约为一个月，并且大多数研究测量了循环系统中抗氧化和抗炎变化的影响，以及血浆脂质值和与氧化应激相关的其他参数。 特别是在“EUROLIVE”研究中，对健康个体的大量样本观察到，橄榄油中的酚类能够保护血脂免受氧化，增加 HDL 胆固醇的浓度以及还原型和氧化型谷胱甘肽之间的关系，然而，dell'F2-isoprostane 没有变化。

2011 年，欧洲食品安全局 (EFSA) 批准了橄榄油多酚（尤其是羟基酪醇）在大于或等于 5 毫克/千克/天的剂量下防止低密度脂蛋白氧化的说法。 其他研究也表明，橄榄油中的多酚与 CRP 的减少、血细胞中致动脉粥样化基因表达的减少以及血压的降低有关。 尽管有证据表明橄榄油多酚具有降低心血管疾病风险的能力，但橄榄成分单独或协同作用的很大一部分可能影响仍未得到探索。 而且，橄榄中含有的很大一部分纤维和多酚类物质，在榨油过程中并没有被提取出来，而是作为副产品被淘汰掉了。

研究的基本原理荞麦粉添加纤维和类黄酮，豌豆粉含有低升糖指数的碳水化合物、蛋白质，也是抗氧化剂的来源，栗子粉带来益生元物质和维生素。 面粉橄榄是橄榄的果实，含有水溶性成分（例如。 纤维和多酚）以及仅部分通过特级初榨橄榄的多不饱和和单不饱和脂肪酸、生育酚和类胡萝卜素的可溶性部分。 这些成分主要是作为特级初榨橄榄油的成分而设计的，并且科学证明有助于改善脂质代谢和血浆脂质结构，有益于心脏健康并防止氧化应激。

根据现有的临床和实验研究，有人建议食用由橄榄糊、荞麦、豌豆和栗子的面粉混合物制成的烘焙产品可以对脂质血浆生物标志物和肠道微生物群产生积极影响（例如，增加双歧杆菌）成人参与者的血浆胆固醇含量处于中等至高水平，即使尚未病理。

合规性声明 本研究将按照方案和临床试验质量管理规范 (GCP) 进行，如 1996 年 ICH GCP、美国联邦法规 (CFR) 和赫尔辛基宣言所述。 通过签署本协议，研究人员同意遵守这些要求。

研究目标

该研究的总体目标是评估在饮食中引入一种含有橄榄酱、荞麦、豌豆和栗子的面粉混合物的新烘焙产品是否能够改变：

主要目标：

1. 粪便微生物群概况；
2. 总胆固醇、低密度脂蛋白、比率/总低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的血浆水平；
3. 甘油三酯的血浆水平；
4. 载脂蛋白 ApoA-I、ApoB 和 Lp (a)。

次要目标：

1. 人体测量指标 2 人体体液中多酚的次级代谢产物 3. 通过质谱 (MS) 分析评估的血浆和尿液中代谢物的概况； 4. 血糖和空腹胰岛素水平； 5. C反应蛋白（PRC）； 6. 高敏C反应蛋白（hsPRC）； 7.尿异前列腺素F2； 8. 血浆中氧化的低密度脂蛋白。

演示实验设计参与者志愿者将在 Casa di Cura Eremo di Arco (TN) 的门诊部分被识别和招募。 参与者将被告知研究的目的和方法，并将根据纳入/排除标准进行预选。 参与者将签署知情同意书，并在参观 T-1 后进入工作室，T-1 在 Casa di Cura Eremo di Arco (TN) 的门诊部分进行，在那里将进行临床和生化健康状况检查。 为了适当监测饮食习惯，符合条件的参与者在第一次访问后将填写饮食日记。

如果受试者符合纳入和排除的所有标准的研究资格，将在访问 T0 时随机接受安慰剂或主动整合。

临床检查、血液和尿液的收集将在启动期开始时禁食约10小时后进行（访视T-1）。 临床测试、血液样本、粪便和尿液的收集将在访问 T0、T1 期间进行。 将在访视 T0 和 T1 之前填写额外的食物日记（连续 4 天）。 不良事件、服用药物和补充剂将由参与者记录在专门的日记中。

研究中的参与者还将被要求填写对盲目提供的每种食物的感官评估，第一次品尝以及每种产品补充 8 周结束时

研究程序 参与者招募 参与者将在 Casa di cura Eremo di Arco (TN) 的门诊部分被确定和招募 参与者将被告知研究的目的和方法，并将根据纳入/排除标准进行预选. 如果符合条件，参与者将签署知情同意书并进入工作室并参观 T-1，这将在临床和生化健康状况下进行。 根据所有纳入/排除标准有资格参加研究的受试者将被纳入研究并随机接受第一次食物补充（测试或对照）以访问 T0（两周后通过磨合).

补充剂

评估合格后，参与者将随机接受与测试或对照产品的烘焙产品整合：

单次每日剂量将包装在由合格小组编码的包装中。 补充将持续八周，双盲，平行。 与两种产品之一（归因于随机化）。

跟进 该项目将包括为期八周的补充、临床检查和血液和尿液的收集，将在约 10 小时的过夜禁食（不包括饮水量）后访问 T-1。 临床检查、采血、收集粪便和尿液检查将在 T0、T1 进行访问：T0 是第一次整合的日期，T1 将在治疗开始后八周。 食物日记将在访问 T-1 时编制并在访问 T0 和 T1 之前分发，以收集访问 T0 和 T1 的数据。

临床评估心电图。 将在筛选 (T-1) 时进行心电图检查。 心电图描记将由 Arco 疗养院 Hermitage 的门诊部分进行审查和解释。

将根据高血压指南 ISH / WHO 2004 人体测量指标测量血压 体重和身高将在标准量表上测量。 这些措施将在没有鞋子、外套或暖和的衣服的情况下进行。 身体质量指数 BMI 以 kg /m2 计算。

腰围（脐带）将以美国国立卫生研究院、国立心肺血液研究所确定的方式进行测量。计算腰围与臀围的比值 (WHR)。

调查问卷 所有信息都将收集并记录在经过验证的调查问卷中，包括个人身份、病史以及有关心血管疾病风险因素、药物使用、身体活动和饮食习惯的信息。 每个参与者还将写一本为期四天的食物日记。

研究中的参与者还将被要求填写第一次盲品和 8 周补充剂结束时提供的每种食物的感官评估。

血液取样和尿液采集 禁食 10 小时后，将从外周静脉抽取血液（≤ 30 毫升）。 收集 24 h 尿液，测量体积并在-80°C 下保存样品。

粪便样本的收集 粪便样本将在样本收集后 12 小时内处理。 每个粪便样本的等分试样将直接冷冻在 -80°C 下用于代谢组学概况分析。

实验室测试 Casa di Cura Eremo di Arco 血液样本的实验室分析将根据血液采集后立即进行的测试的要求进行离心。 将分离血浆或血清，部分立即进行测试，剩余部分储存在-80°C。

总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和葡萄糖将用酶法进行评估。 低密度脂蛋白胆固醇将用酶法进行分析测量。

胰岛素水平将通过电化学发光来评估。血液计数和血小板计数将通过阻抗测量法进行评估。 C 反应蛋白 (CRP) 将通过比浊法测量。 高灵敏度 C 反应蛋白 (hsPCR) 将通过比浊法进行测量。

载脂蛋白 AI (ApoA-I)、ApoB 和 Lp (a) 通过免疫比浊法测定。

将通过测量尿液中的葡萄糖浓度来进行验证不存在糖尿的测试。

Fondazione Edmund Mach 的实验室测试 [EMF] 尿液和血浆代谢组学概况。 在通过色谱固相（SepPack 柱）纯化后，将通过特定的 EIA 套件测量尿液中的 F2-异前列烷作为氧化应激的量度。

血浆中氧化的 LDL 分析将借助 ELISA 试剂盒进行。

尿液和血液（血浆和血清）样本将同时进行靶向代谢组学分析（非挥发性化合物的 UPLC-MS / MS 和挥发性化合物的 GC-MS / MS）分析非靶向代谢组学（ULPC -Q -TOF-MS 和 Nano -FTMS-Q-TOF（非挥发性化合物）和 GC-TOF（用于挥发性化合物）。 对于目标血浆代谢物的概况，将使用基于 MS 的 Biocrates AbsoluteIDQ ® Kit P180，生成与糖尿病风险相关的 180 种人类代谢物的精确定量数据。 此外，特定的靶向分析将应用于血清胆汁酸、短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）的脂质谱以及生物体液（包括粪便）中微生物源多酚代谢物的定量分析，采用UPLC / QQQ-MS/MS。

粪便微生物群分析。 将使用荧光探针原位杂交 (FISH) 方法评估特定细菌种群粪便微生物群的变化。

粪便微生物群的变化也将使用使用焦磷酸测序 454 的宏基因组学方法进行评估。 简而言之，收集粪便样本后（n = 128，来自 64 名受试者在食用每种食物测试和安慰剂前后的不同时间 T0、T1 的 2 个粪便样本）将使用试剂盒 SPIN FastDNA（MPbio）提取细菌基因组 DNA ) 特定于粪便。 使用细菌 16S rRNA 基因（高变区 V1-V3）特异的引物，通过 PCR 扩增进行，然后对扩增的 V1-V3 进行 454 焦磷酸测序。

将使用 GS FLX Titanium Chemistry with adapter Multiplex Identifier (MID) 获得长度为 600 bp 的序列，通过比较公开的 16S rRNA 系统发育数据库，通过允许分配到人类属水平的管道 QIIME 进行分析肠道菌群。 它将为每个粪便样本生成总共约 20,000 个序列。 作为微生物生态学的质量控制和分析，将使用多变量统计来关联食用食品测试或安慰剂后粪便微生物群组成的变化。

随机化盲法参与者将被随机分配，但按性别和年龄平均分配到两种治疗之一：烘焙产品测试或控制产品，甚至使用特定软件。 临床研究人员、研究人员和实验室人员将对随机分组不知情。

治疗 将通过食用烘焙产品（测试）将补充剂引入日常饮食，每天食用 90 克含有来自荞麦、豌豆、栗子的橄榄粉的产品。 食物将提供模拟控制卡路里摄入量。 研究中的产品（测试或对照）将以包装的形式提供，包装上将以当地语言标记研究代码。 制造商名称、患者人数、研究访问次数。 产品将从访问 T0 开始分发给参与者。

研究持续时间和计划 在评估资格后，参与者将被随机分为两组（产品测试组或对照组），随后将进行 8 周的膳食补充。

研究的总持续时间，包括启动期（磨合期）和治疗，将为 10 周。

招聘将在伦理委员会批准后的三个月内开始。

磨合将在第一次访问 (T-1) 的两周内开始。 受试者将在 10 个月内招募，研究将在首次招募后的 12 个月内完成。

研究中止标准 根据赫尔辛基宣言、ICH 良好临床实践标准和美国《食品和药物管理局 (FDA) 条例》，个人有权随时退出研究并出于任何原因，不影响医生或机构未来的医疗护理。 调查人员也有权撤回研究对象（见下文）。 如果某人（或合法授权代表）决定退休，将尽一切努力尽可能完成和报告观察结果。 最终的综合评估应在受试者退出时进行，其中必须记录退出的原因，并且在任何情况下都应尝试进行后续评估。

由于以下原因，可以将受试者从研究中移除：

实验者违反协议 受试者没有有意义的遵守 受试者拒绝继续治疗或评论 不可接受的毒性 研究人员决定关闭符合受试者的最佳医学利益 不明确的疾病或并发症事件 使用与研究不相容的伴随药物。 怀孕 滥用酒精或药物 那些停止或退出研究的人将不会被替换。

终止程序

如果个人在研究完成前停止，将记录原因和截止日期。 应记录研究中最后一剂食物的日期。 在提前终止的情况下，必须执行以下程序：

临床测试（收缩压和舒张压、心率、体重和身高以计算 BMI 和腰围和臀围）。

采血和粪便采集。 食物频率问卷（每周一次）。 如果个人无法返回进行后续访问，调查人员将摸索通过电话联系此人以跟踪任何不良事件。

如果某人撤回在工作室接受食物的同意，我们将鼓励您继续参与研究而不接受治疗以收集安全数据。

所研究产品的可靠性程序 产品（测试或控制）将以当地语言标记的包装提供，标有研究代码、站点代码、制造商名称、参与者人数、研究的访问次数、批次数量、存储说明和有效期。 产品将从访问 T0 开始分发给参与者。

代码随机化每个参与者的按性别和年龄随机化的代码将由合格的感官质量小组（Edmund Mach 基金会研究与创新中心营养和食品质量部的 QS）存储在密封的信封中。

数据来源控制 研究期间收集的所有数据都将从第一手来源获得，并作为研究对象记录在书面文件和电子病历中。 临床、实验室结果和心电图结果将记录在受试者的电子病历档案中。 任何数据都不会直接插入“病例报告表”（CRF），而无需从主要来源（例如纸质记录或电子记录）转移。

伴随药物治疗在研究开始前一个月内从受试者服用和/或在研究期间施用的任何药物将被视为伴随治疗。 此类治疗必须记录在 CRF 的适当页面和受试者的医疗记录中。 必须清楚地记录研究期间伴随治疗的任何变化，并记录变化的原因。

将向每位参与者的医生发送一封信，具体说明与研究不相容的治疗方法。 研究期间不允许使用以下药物：血液稀释剂、抗高血压药、降脂药、β受体阻滞剂、全身性皮质类固醇、抗精神病药、抗生素、泻药、维生素补充剂、抗氧化剂和矿物质、膳食纤维、益生元（例如菊糖、低聚果糖）和益生菌。 因此，如果受试者需要与研究不相容的药物治疗，则治疗医师会通知受试者终止研究并通知研究负责人并遵循提前终止的程序。

依从性评级 为了评估对补充剂的依从性，他们将在 T0、T1 时通过食品测试补充受试者的尿酚。 此外，每周结束时所有未使用或空的包装将退还给实验者。

方法 安全性 在以前的研究中，与食用橄榄、荞麦、豌豆粉、栗粉制成的产品相关的研究没有安全问题。

该研究将由 Arco 的 Casa di Cura Eremo 的医疗和辅助医疗人员监督。 在整个研究过程中仍将记录不良事件。 引起临床体征或症状或需要治疗干预的异常实验室值将被及时通知给受试者，如果受试者明确表示希望以知情同意的形式接收此类信息。 如果需要的治疗干预与研究不相容，或者如果您遇到不良事件导致该受试者纳入研究的标准发生变化，受试者可以提前退出研究。 受试者仍然可以随时退出研究，以防研究因提前终止程序后感到不适。

统计分析 基本特征按补充类型列出：连续变量表示为平均值 +/- 标准差或具有四分位数范围的中位数，分类变量表示为百分比。 具有不对称分布的数据将在分析之前进行日志处理。 将使用单变量和多变量统计方法评估两种补充剂之间的差异。 干预前后的媒介将与一般线性模型 (ANOVA) 进行比较，以进行重复测量或配对数据。 您将执行简单和多元线性回归以确定自变量之间的关系；我们还将运行测试以评估在补充剂类型中检测到的依从性差异。 结果表示为平均值 +/- SEM，当 P < 0.05 时，差异将被视为显着。 具有不对称分布的数据将在分析之前进行日志处理。

主要分析将基于对食用测试产品后和食用对照产品后平均水平差异的比较。 还将测量每次补充结束时的平均值 (T1) 与相对平均基线值 (T0) 之间的差异。

治疗组之间的时间差异将通过重复测量的方差分析来评估。显着性水平将被认为在两条尾部<0.05。

每种补充剂的样本量已确定为 32，以检测血浆中低密度脂蛋白胆固醇的降低等于约 15.44 mg/dl，标准偏差为 14.28 mg/dl，使用等式 Snedecor 和 Cochran，其中 α 等于 0.05 和 1 -β 等于 0.9 (Dell et al., 2002)。 根据此公式，要注册的最少受试者数等于 28。 考虑到可能的中途退出，32 人补充了测试产品，32 人补充了对照产品，总共 64 名志愿者参加了这项研究。

评估是基于血浆中低密度脂蛋白胆固醇降低的丰度，基于欧洲营养学杂志发表的一项平行研究中报告的低密度脂蛋白胆固醇的测量值（平均值和标准差）。 参数低密度脂蛋白胆固醇，除了被认为对人类健康有影响外，其限制性更强，需要比肠道微生物群落改变程度更长的观察时间。

直接访问源数据/文件 监管机构可能希望对临床研究进行检查，以评估是否符合 GCP 原则。 监管机构也可能希望进行检查（在试验期间或试验完成后）。 如果监管机构和/或临床试验伦理委员会 c/o APSS Trento 要求进行检查，则研究人员必须同意向监管机构提供与研究相关的文件。

数据管理和记录数据和文档的来源被定义为记录数据的第一个地方。 任何原始文件不应在同一地点保存和提供。 研究人员必须保留每个参与研究的人的原始文件。

试验期间在 CRF 上收集的数据将以匿名方式记录，并用数字或符号标识。 如果在特殊情况下，出于安全或监管的原因，有必要识别此人，OlioCRU Ltd 和研究人员必须对此类信息保密。

CRF 中输入的所有数据均应清晰可辨，并以黑色墨水记录。 如果您需要更正，则应通过单行删除条目并在项目本身旁边输入正确的信息来进行。 更正必须由研究者或指定的合格人员签名并注明日期。