Microbiota e microambiente immunitario nella pouchite (MEP1)

Obiettivi di studio

L'ipotesi di lavoro è che un'interruzione dell'omeostasi del microbiota intestinale, spontanea o causata dalla deregolazione del meccanismo immunitario innato all'interno della mucosa della sacca, contribuisca all'insorgenza di pouchite cronica/recidivante. Tenendo conto del fatto che la colonizzazione batterica della mucosa della sacca può essere studiata idealmente sin dalla sua generazione, questo può essere considerato un modello ideale per studiare l'interazione tra microbiota intestinale e sistema immunitario innato. Pertanto, l'obiettivo di questa Unità di Ricerca è quello di stabilire come la disbiosi e la disfunzione del meccanismo dell'immunità innata si stabiliscano e come questa disfunzione contribuisca all'insorgenza e al mantenimento della pouchite. Per affrontare questi problemi fisiopatologici rilevanti alla luce delle loro implicazioni terapeutiche, abbiamo in programma di eseguire uno studio randomizzato in doppio cieco probiotici vs placebo in pazienti che saranno sottoposti a colectomia e successiva anastomosi tasca ileale-anale per arruolare i pazienti al momento della colura ileostomica a :

1. valutare la composizione e le proprietà patogene del microbiota che colonizza la mucosa della tasca dopo la chiusura dell'ileostomia;
2. determinare in che modo l'espressione e lo stato di attivazione del sistema immunitario innato in diversi tipi di cellule e distretti anatomici della mucosa della tasca sono correlati alla chiusura dell'ileostomia;
3. follow-up dell'esito clinico delle tasche anali alla luce dell'interazione tra microbiota e sistema immunitario innato.

Disegno dello studio In un periodo di due anni abbiamo calcolato di arruolare almeno 32 pazienti che saranno randomizzati alla chiusura dell'ileostomia in un gruppo trattato con placebo (16 pazienti) e in un gruppo trattato con integrazione orale di Lactobacillus casei GD per 8 settimane (16 pazienti). I campioni di mucosa saranno raccolti alla chiusura dell'ileostomia e all'endoscopia della tasca a 8 settimane e a 12 mesi. Considereremo candidati eleggibili tutti i pazienti con CU che saranno sottoposti a proctocolectomia riparativa con anastomosi anale della tasca ileale e che frequenteranno il nostro ambulatorio per endoscopia di routine e follow-up clinico. I pazienti con cuffite (infiammazione del residuo della mucosa rettale) o morbo di Crohn della tasca (con fistole perianali o con infiammazione dell'arto ileale afferente), nonché i pazienti che avranno ricevuto terapia antibiotica o probiotica nei 30 giorni precedenti saranno esclusi dallo studio. I pazienti con PDAI>7 saranno considerati come pouchite conclamata. Il protocollo rispetterà i principi della Dichiarazione di Helsinki modificata.

Ad ogni paziente verranno fornite informazioni dettagliate sugli obiettivi e sulla metodologia dello studio e verrà chiesto di fornire un consenso informato scritto prima dell'arruolamento. Durante questo periodo ai pazienti verrà chiesto di sottoporsi a endoscopia della tasca con biopsie della mucosa, feci e prelievo di sangue in tre momenti seguenti: a) prima della chiusura dell'ileostomia, b) 2 mesi dopo la chiusura dell'ileostomia, c) 12 mesi dopo la chiusura dell'ileostomia (o prima, in caso di pouchite conclamata). Sulla base di criteri clinici, endoscopici e istologici e PDAI valuteremo la gravità della malattia [5]. Sulla base dell'infiammazione acuta istologica ed endoscopica e dei sintomi clinici, i pazienti con un PDAI totale >7 saranno classificati come affetti da pouchite acuta.

L'endoscopia della sacca verrà eseguita senza sedazione. L'ansa afferente, la tasca saranno attentamente esaminate e verrà eseguito il prelievo bioptico: due campioni per la caratterizzazione del microbiota, due per l'istologia convenzionale, quattro per la biologia molecolare e l'analisi citofluorimetrica. Le biopsie saranno gestite e conservate in base ai diversi studi.

Valutazione del microbiota:

Per caratterizzare i batteri aderenti alla sacca, le biopsie della mucosa della sacca ileale saranno immediatamente lavate delicatamente per rimuovere i microbi debolmente aderenti e quindi congelate in azoto liquido per la successiva estrazione del DNA, o poste in terreno tioglicolato per preservare i microbi anaerobici per le successive colture.

L'abbondanza relativa di phyla batterici nei campioni fecali sarà stimata mediante il sequenziamento degli ampliconi PCR mirati al gene 16S rRNA per i campioni di DNA estratti da ciascun campione fecale. La PCR verrà eseguita utilizzando il set di primer (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ e 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′) che bersaglia la regione V5-V6 dei geni 16S rRNA [38]. Per amplificare la regione mirata, 1 μl di DNA estratto fungerà da modello nelle reazioni da 50 μl utilizzando la premiscela Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Giappone). I prodotti delle due reazioni PCR di ricondizionamento per campione saranno combinati e purificati utilizzando colonne di purificazione PCR QIAquick (Qiagen). I prodotti di PCR amplificati saranno utilizzati come template per il pyrosequencing con la piattaforma GS Junior (454 Life Sciences). Il pirosequenziamento verrà eseguito seguendo le istruzioni del produttore utilizzando i tag MID. Prevediamo di ottenere in media circa 15.000 sequenze per ogni campione. I dati ottenuti saranno sottoposti ad un'analisi dei dati effettuata mediante strumenti computazionali. La tipizzazione dell'rRNA batterico sarà eseguita mediante ricerca BLASTN contro il database completo di rRNA "silva" release 94 [39] utilizzando una soglia di E-value <1E-40. Tutte le specie batteriche ottenute da ciascun campione fecale saranno classificate nei loro gruppi filogenetici e sarà stimata la proporzione dei diversi phyla. La stima dell'unità tassonomica operativa (OTU) sarà eseguita dal programma ESPRIT utilizzando le impostazioni predefinite [40].

Per le colture microbiologiche, le biopsie immediatamente poste in terreno tioglicolato (per proteggere i microbi anaerobici dall'esposizione all'ossigeno) saranno ulteriormente manipolate in una cappa anaerobica riempita con atmosfera C02:H2 (95:5). Le biopsie saranno lavate in soluzione salina sterile colorante gassata addizionata con ditioeritritolo allo 0,016% per rimuovere il muco e successiva lisi cellulare ipotonica in acqua sterile, seminate in opportune piastre di agar per valutare la microflora superficiale. [35]. I campioni saranno seminati su terreni non selettivi (Brain Heart Infusion Agar, BHA) e selettivi per Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) e Lactobacillus spp (Rogosa SL agar).

Le piastre di agar BHA e MacConkey saranno coltivate in condizioni anaerobiche e aerobiche (rispettivamente 24 e 72 ore), mentre le piastre di Rogosa SL Agar saranno coltivate solo in condizioni anaerobiche (72 ore) a 37°C. Le colonie saranno contate, raggruppate in base all'aspetto morfologico e sottoposte ad analisi morfologica mediante colorazione di Gram (Biolife S.r.l.). Quindi i microbi saranno sottoposti a caratterizzazione molecolare, eseguita mediante sequenziamento di amplificati PCR di rRNA 16S utilizzando un "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Gli isolati saranno ulteriormente caratterizzati in base al loro potenziale di patogenicità (es. profilo tossicogeno e resistenza agli antibiotici).

Ambiente immunitario innato della mucosa

Includerà l'analisi della rete infiammatoria nella mucosa della sacca

1. quantificazione dei livelli di citochine [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 e IL-4 e di chemochine [MCP1,] mediante saggio immunologico per citochine Bio-Plex. Una biopsia sarà omogeneizzata e il sopranatante trasparente utilizzato per la quantificazione contemporanea di più citochine e chemochine mediante saggi progettati su misura;
2. analisi della rete di TLR (quantificazione dell'mRNA e distribuzione delle proteine) mediante RT-PCR quantitativa e immunoistochimica, rispettivamente;
3. valutazione dello stato di attivazione di macrofagi, cellule dendritiche, linfociti infiltranti valutazione di marcatori di superficie (es.) e pattern di citochine intracellulari (es. TNF, IFN, IL4, IL10) mediante analisi citofluorimetrica. Due biopsie saranno sottoposte a digestione enzimatica delicata e quindi colorate con anticorpi opportunamente marcati diretti contro antigeni di superficie o citochine intracellulari.

Attività antimicrobica della mucosa. Per caratterizzare la rete peptidica antibatterica nella mucosa della sacca responsabile della formazione del microbiota aderente: a) determineremo le proprietà antimicrobiche degli estratti della mucosa eseguendo test di tossicità antibatterica in vitro [37]; b) quantificare le defensine antimicrobiche epiteliali e leucocitarie (come Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) mediante RT-PCR quantitativa.

Valutazione istologica:

Per l'esame istologico di routine due biopsie saranno fissate in 4% PFA per 24 ore, quindi disidratate e incluse in paraffina, e le sezioni (5 μm di spessore) saranno tagliate e sottoposte a colorazione standard di ematossilina/eosina (H&E). Per quantificare la gravità infiammatoria verrà utilizzato il Floren et al. punteggio [41].

Valutazione dell'infiammazione sistemica e intestinale

Lo stato infiammatorio sistemico e locale sarà valutato ad ogni timeline sperimentale da: velocità di eritrosedimentazione (ESR), conta dei globuli bianchi (WBC), conta ematica delle piastrine (PLT), CRP e lattoferrina fecale, rispettivamente. La VES sarà misurata con il metodo Westergren. La CRP sarà rilevata mediante immuno-nefelometria (normale: <6 mg/l; patologica >6mg/l). Le proteine ​​totali e l'albumina saranno valutate con il metodo del biureto. I globuli bianchi, la conta piastrinica e l'emoglobinemia saranno ottenuti con un conteggio standard delle cellule del sangue. La lattoferrina fecale sarà dosata mediante un test ELISA che utilizza anticorpi policlonali di coniglio specifici per la lattoferrina umana su campioni di feci congelate.

analisi statistica

L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando Windows Microsoft Excel e un software Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). I dati continui saranno espressi come mediana (range); i dati dicotomici saranno espressi come frequenza e proporzione. Verranno utilizzati test non parametrici. La correlazione tra ceppi batterici e parametri infiammatori sarà calcolata con il test di Spearman per valutare il ruolo etiopatogenetico di ciascun ceppo. Il coefficiente di correlazione rilevante sarà non inferiore a 0,50 e, fissando un livello di significatività statistica a due code a 0,05 e una potenza a 0,20, la conseguente numerosità campionaria dovrà essere di almeno 29 pazienti. Il confronto tra pouchite e pouch sana verrà eseguito con il test U di Mann-Whitney. Fissato un livello di significatività statistica pari a 0,05 e una potenza pari a 0,20 la conseguente numerosità campionaria richiesta per il confronto sarà di 16 pazienti per ciascun gruppo. In conclusione, almeno 32 pazienti saranno arruolati in questo studio. La significatività statistica sarà fissata a p<0.05.