Mikrobiota og immunmikromiljø i pouchitis (MEP1)

Studiemål

Arbejdshypotesen er, at en forstyrrelse af tarmmikrobiotahomeostase, enten spontan eller forårsaget af dereguleringen af ​​det medfødte immunitetsmaskineri i poseslimhinden, bidrager til opståen af ​​kronisk/tilbagevendende pouchitis. Under hensyntagen til, at bakteriel kolonisering af poseslimhinden ideelt set kan studeres siden dens generering, kan dette betragtes som en ideel model til at studere samspillet mellem tarmmikrobiota og medfødt immunsystem. Derfor er målet for denne forskningsenhed at fastslå, hvordan dysbiose og medfødt immunitets maskineri dysfunktion etableres, og hvordan denne disfunktion bidrager til opståen og vedligeholdelsen af ​​pouchitis. For at løse disse relevante patofysiologiske problemer i lyset af deres terapeutiske implikationer, planlægger vi at udføre et randomiseret dobbeltblindt studie med probiotika vs placebo hos patienter, som vil gennemgå kolektomi og efterfølgende ileal pouch-anal anastomose til at indskrive patienterne på tidspunktet for ileostomifarve til :

1. evaluere sammensætning og patogene egenskaber af mikrobiotaen, der koloniserer poseslimhinden efter ileostomi-lukning;
2. bestemme, hvordan ekspression og aktiveringsstatus af det medfødte immunsystem i forskellige celletyper og anatomiske distrikter i poseslimhinden relaterer sig til ileostomilukning;
3. følge op på det kliniske resultat af analposer i lyset af mikrobiota-medfødt immunsystems samspil.

Undersøgelsesdesign I en periode på to år beregnede vi at inkludere mindst 32 patienter, som vil blive randomiseret ved lukning af ileostomi i en gruppe, der fik placebo (16 patienter) og i en gruppe, der fik lactobacillus casei GD oralt tilskud i 8 uger (16 patienter). Slimhindeprøver vil blive høstet ved lukning af ileostomi og ved poseendoskopi efter 8 uger og 12 måneder. Vi vil overveje kvalificerede kandidater for alle patienter med UC, som vil gennemgå genoprettende proctocolectomy med ileal pouch anal anastomose, og som vil deltage i vores ambulatorium og rutinemæssig endoskopisk klinik klinisk opfølgning. Patienter med cuffitis (betændelse i endetarmsslimhinderest) eller Crohns sygdom i posen (med perianale fistler eller med betændelse i det afferente ileale lem), samt patienter, der vil have modtaget antibiotika- eller probiotisk behandling i løbet af de foregående 30 dage udelukket fra undersøgelsen. Patienter med PDAI>7 vil blive betragtet som åbenlys pouchitis. Protokollen vil være i overensstemmelse med principperne i den ændrede Helsinki-erklæring.

Hver patient vil blive forsynet med detaljerede oplysninger om undersøgelsens mål og metodologi og vil blive bedt om at give skriftligt, informeret samtykke før tilmelding. I denne periode vil patienter blive bedt om at gennemgå poseendoskopi med slimhindebiopsier, fæces- og blodprøvetagning på tre følgende tidspunkter: a) før ileostomilukning, b) 2 måneder efter ileostomilukning, c) 12 måneder efter ileostomilukning (eller før, i tilfælde af åbenlys pouchitis). Baseret på kliniske, endoskopiske og histologiske kriterier og PDAI vil vi vurdere sygdommens sværhedsgrad [5]. Baseret på histologisk og endoskopisk akut inflammation samt kliniske symptomer vil patienter med en samlet PDAI >7 blive klassificeret som havende akut pouchitis.

Endoskopi af posen vil blive udført uden sedation. Den afferente løkke, posen vil blive omhyggeligt undersøgt og biopsiprøvetagning vil blive udført: to prøver til mikrobiotakarakterisering, to til konventionel histologi, fire til molekylærbiologi og cytofluorimetrisk analyse. Biopsier vil blive håndteret og opbevaret i overensstemmelse med de forskellige undersøgelser.

Mikrobiota vurdering:

For at karakterisere bakterier, der klæber til posens slimhinde, vil biopsier fra ileal-posen enten straks blive forsigtigt vasket for at fjerne løst vedhæftende mikrober og derefter frosset i flydende nitrogen til efterfølgende DNA-ekstraktion, eller anbragt i thioglycolat-medium for at bevare anaerobe mikrober til efterfølgende kulturer.

Relativ forekomst af bakteriephyla i fæcesprøver vil blive estimeret ved at sekventere PCR-amplikonerne, der er målrettet mod 16S rRNA-genet for DNA-prøverne ekstraheret fra hver fæcesprøve. PCR vil blive udført ved hjælp af primersættet (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' og 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3'), der er målrettet mod V5-V6-regionen af ​​16S rRNA-generne [38]. For at amplificere den målrettede region vil 1 μl ekstraheret DNA tjene som skabelon i 50 μl reaktioner ved hjælp af Prime STAR HS premix (Takara Bio Inc., Japan). Produkter fra de to rekonditionerende PCR-reaktioner pr. prøve vil blive kombineret og oprenset ved hjælp af QIAquick PCR-oprensningskolonner (Qiagen). De amplificerede PCR-produkter vil blive brugt som skabelon til pyrosequencing med GS Junior platformen (454 Life Sciences). Pyrosequencing vil blive udført ved at følge producentens anvisninger ved hjælp af MID-tags. Vi forventer at opnå omkring 15.000 sekvenser for hver prøve i gennemsnit. De opnåede data vil blive udsat for en dataanalyse udført af beregningsværktøjer. Bakteriel rRNA-typning vil blive udført ved BLASTN-søgning mod den omfattende rRNA-database "silva" release 94 [39] ved hjælp af en tærskel på E-værdi <1E-40. Alle bakteriearter opnået fra hver fæcesprøve vil blive klassificeret i deres fylogenetiske grupper, og andelen af ​​forskellige phyla vil blive estimeret. Estimeringen af ​​operationel taksonomisk enhed (OTU) vil blive udført af programmet ESPRIT ved hjælp af standardindstillinger [40].

For mikrobiologiske kulturer vil biopsier, der straks placeres i thioglycolat-medium (for at beskytte anaerobe mikrober mod ilteksponering), blive manipuleret yderligere i en anaerob hætte fyldt med C02:H2 (95:5) atmosfære. Biopsier vil blive vasket i steril farvegasbehandlet saltvandsopløsning suppleret med 0,016% dithioerythritol for at fjerne slimet og efter cellehypotonisk lysis i sterilt vand, udsået i passende agarplader for at evaluere den overfladiske mikroflora. [35]. Prøver vil blive podet på ikke-selektive (Brain Heart Infusion Agar, BHA) og selektive medier for Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) og Lactobacillus spp (Rogosa SL agar).

BHA- og MacConkey-agarplader vil blive dyrket under anaerobe og aerobe forhold (henholdsvis 24 og 72 timer), mens Rogosa SL-agarplader kun vil blive dyrket under anaerobe forhold (72 timer) ved 37°C. Kolonier vil blive talt, grupperet på basis af morfologisk udseende og underkastet morfologisk analyse ved Gram-farvning (Biolife S.r.l.). Derefter vil mikrober blive udsat for molekylær karakterisering, udført ved sekventering af PCR-amplikoner af 16S rRNA ved hjælp af et "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Isolater vil blive yderligere karakteriseret i henhold til deres patogenicitetspotentiale (dvs. toksigen profil og antibiotikaresistens).

Slimhinde medfødt immunmiljø

Analyse af det inflammatoriske netværk i poseslimhinden vil omfatte

1. kvantificering af cytokiner [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 og IL-4 og kemokiner [MCP1,] niveau ved Bio-Plex cytokin immunoassay. En biopsi vil blive homogeniseret, og den klare supernatant vil blive brugt til den moderne kvantificering af flere cytokiner og kemokiner ved specialdesignede assays;
2. analyse af TLRs netværk (mRNA kvantificering og proteinfordeling) ved henholdsvis kvantitativ RT-PCR og immunhistokemi;
3. vurdering af aktiveringsstatus for makrofager, dendritiske celler, infiltrerende lymfocytter, der evaluerer overflademarkører (dvs.) og intracellulært cytokinmønster (dvs. TNF, IFN, IL4, IL10) ved cytofluorimetrisk analyse. To biopsier vil blive udsat for skånsom enzymatisk fordøjelse og derefter farvet med korrekt mærkede antistoffer rettet mod overfladeantigener eller intracellulære cytokiner.

Slimhinde anti-mikrobiel aktivitet. For at karakterisere det antibakterielle peptidnetværk i poseslimhinden, der er ansvarlig for at forme den adhærente mikrobiota, vil vi a) bestemme de antimikrobielle egenskaber af slimhindeekstrakter ved at udføre in vitro antibakteriel toksicitetsassay [37]; b) kvantificere epitel- og leukocyt-afledte antimikrobielle defensiner (såsom Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) ved kvantitativ RT-PCR.

Histologisk vurdering:

Til rutinemæssig histologisk undersøgelse vil to biopsier blive fikseret i 4 % PFA i 24 timer, derefter dehydreret og indlejret i paraffin, og sektioner (5 μm tykke) vil blive skåret ud og udsat for standard hæmatoxylin/eosin (H&E)-farvning. For at kvantificere inflammatorisk sværhedsgrad vil Floren et al. score [41].

Systemisk og tarmbetændelsesvurdering

Systemisk og lokal inflammatorisk tilstand vil blive vurderet ved hver eksperimentel tidslinje ved: hhv. erytrocytsedimentationshastighed (ESR), antal hvide blodlegemer (WBC), blodpladetal (PLT), CRP og fækalt lactoferrin. ESR vil blive målt ved Westergren-metoden. CRP vil blive påvist ved immunnephelometri (normalt: <6 mg/l; patologisk >6mg/l). Totalprotein og albumin vil blive vurderet med biuretmetoden. WBC, blodpladetal og hæmoglobinæmi vil blive opnået med standard fuldt blodcelletal. Fækalt lactoferrin vil blive doseret ved en ELISA-test, der bruger polyklonale kaninantistoffer, der er specifikke for humant lactoferrin på frosne afføringsprøver.

Statistisk analyse

Statistisk analyse vil blive udført ved hjælp af Windows Microsoft Excel og en Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) software. Kontinuerlige data vil blive udtrykt som median (interval); dikotomiske data vil blive udtrykt som frekvens og proportion. Ikke-parametriske tests vil blive brugt. Korrelation mellem bakteriestammer og inflammatoriske parametre vil blive beregnet med Spearman test for at evaluere den etio-patogenetiske rolle af hver stamme. Relevant korrelationskoefficient vil ikke være ringere end 0,50, og ved at sætte et statistisk signifikansniveau på 0,05 og power på 0,20, skal den deraf følgende stikprøvestørrelse være mindst 29 patienter. Sammenligning mellem pouchitis og sund pose vil blive udført med Mann-Whitney U-test. Indstil et niveau af statistisk signifikans til 0,05 og en potens ved 0,20, den deraf følgende stikprøvestørrelse, der kræves til sammenligning, vil være 16 patienter for hver gruppe. Som konklusion vil mindst 32 patienter blive inkluderet i denne undersøgelse. Statistisk signifikans vil blive sat til p<0,05.