储袋炎中的微生物群和免疫微环境 (MEP1)

学习目标

工作假设是肠道微生物群稳态的破坏，无论是自发的还是由储袋粘膜内先天免疫机制失调引起的，都会导致慢性/复发性储袋炎的发作。 考虑到袋粘膜的细菌定植自产生以来就可以得到理想的研究，这可以被认为是研究肠道微生物群与先天免疫系统之间相互作用的理想模型。 因此，该研究单位的目标是确定菌群失调和先天免疫机制功能障碍是如何产生的，以及这种功能障碍如何导致储袋炎的发生和维持。 为了根据其治疗意义解决这些相关的病理生理学问题，我们计划在将接受结肠切除术和随后的回肠储袋肛管吻合术的患者中进行益生菌与安慰剂的随机双盲研究，以在回肠造口术时招募患者:

1. 评估在回肠造口术关闭后定植在袋粘膜上的微生物群的组成和致病特性；
2. 确定先天免疫系统在不同细胞类型和储袋粘膜解剖区域中的表达和激活状态如何与回肠造口闭合相关；
3. 根据微生物群-先天免疫系统的相互作用，跟踪肛袋的临床结果。

研究设计 在两年期间，我们计算出至少招募 32 名患者，这些患者将在回肠造口关闭时随机分配到接受安慰剂的组（16 名患者）和接受干酪乳杆菌 GD 口服补充剂 8 周的组（16 名患者）。 粘膜样本将在 8 周和 12 个月时在回肠造口闭合和储袋内窥镜检查时采集。临床随访。 患有袖带炎（残留直肠粘膜的炎症）或储袋克罗恩病（伴有肛周瘘管或伴有回肠传入肢炎症）的患者，以及在过去 30 天内接受抗生素或益生菌治疗的患者将被排除在研究之外。 PDAI>7 的患者将被视为明显的储袋炎。 该议定书将遵守经修订的赫尔辛基宣言的原则。

将向每位患者提供有关研究目的和方法的详细信息，并要求他们在入组前签署知情同意书。 在此期间，患者将被要求在以下三个时间接受粘膜活检、粪便和血液采样的袋内镜检查：a) 回肠造口术关闭前，b) 回肠造口术关闭后 2 个月，c) 回肠造口术关闭后 12 个月（或之前，在明显的储袋炎病例）。 根据临床、内窥镜和组织学标准以及 PDAI，我们将评估疾病的严重程度 [5]。 基于组织学和内窥镜急性炎症以及临床症状，总 PDAI > 7 的患者将被归类为患有急性储袋炎。

袋的内窥镜检查将在没有镇静的情况下进行。 将仔细检查传入环路和小袋并进行活检取样：两个样本用于微生物群表征，两个样本用于常规组织学，四个样本用于分子生物学和细胞荧光分析。 活检将根据不同的研究进行处理和储存。

微生物群评估：

为了表征粘附在回肠袋中的袋粘膜活检的细菌，将立即轻轻清洗以去除松散粘附的微生物，然后在液氮中冷冻以用于随后的 DNA 提取，或置于巯基乙酸盐培养基中以保存厌氧微生物用于后续培养。

粪便样本中细菌门的相对丰度将通过对从每个粪便样本中提取的 DNA 样本的 16S rRNA 基因的 PCR 扩增子进行测序来估计。 将使用针对 16S rRNA 基因的 V5-V6 区域的引物组（784F：5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3'和 1061R：5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3'）进行 PCR [38]。 为了扩增目标区域，使用 Prime STAR HS 预混液（Takara Bio Inc.，日本），将 1 μl 提取的 DNA 作为 50 μl 反应的模板。 每个样品的两个再调节 PCR 反应的产物将使用 QIAquick PCR 纯化柱（Qiagen）合并和纯化。 扩增的 PCR 产物将用作 GS Junior 平台 (454 Life Sciences) 焦磷酸测序的模板。 焦磷酸测序将按照制造商的说明使用 MID 标签进行。 我们期望平均每个样本获得大约 15,000 个序列。 获得的数据将通过计算工具进行数据分析。 细菌 rRNA 分型将通过 BLASTN 搜索针对综合 rRNA 数据库“silva”第 94 版 [39] 使用 E 值 <1E-40 的阈值进行。 从每个粪便样本中获得的所有细菌种类将被分类到它们的系统发育群中，并将估计不同门的比例。 操作分类单元 (OTU) 的估计将由程序 ESPRIT 使用默认设置 [40] 执行。

对于立即置于巯基乙酸盐培养基中的微生物培养物活检（以保护厌氧微生物免受氧气暴露）将在充满CO 2 ：H 2 （95：5）气氛的厌氧通风橱中进一步操作。 活组织检查将在添加有 0.016% 二硫赤藓糖醇的无菌染料充气盐水溶液中洗涤以去除粘液，并在无菌水中进行细胞低渗裂解后，接种在适当的琼脂平板中以评估表面微生物群落。 [35]。 样品将接种在非选择性（脑心浸液琼脂，BHA）和肠杆菌属（MacConkey 琼脂）和乳杆菌属（Rogosa SL 琼脂）的选择性培养基上。

BHA 和 MacConkey 琼脂平板将在厌氧和有氧条件下培养（分别为 24 小时和 72 小时），而 Rogosa SL 琼脂平板将仅在 37°C 的厌氧条件下（72 小时）培养。 将对菌落进行计数，根据形态学外观分组并通过革兰氏染色（Biolife S.r.l.）进行形态学分析。 然后微生物将受到分子表征，通过使用“Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit”[24] 对 16S rRNA 的 PCR 扩增子进行测序来进行。 分离株将根据其致病性潜力（即 产毒概况和抗生素耐药性）。

粘膜先天免疫环境

囊粘膜中炎症网络的分析将包括

1. 通过 Bio-Plex 细胞因子免疫测定法定量细胞因子 [IL-1ß、IL-6、TNF-、TGF ß、IL-10 和 IL-4 以及趋化因子 [MCP1] 水平。 一份活检将被匀浆，透明的上清液用于通过定制设计的测定法对多种细胞因子和趋化因子进行当代量化；
2. 分别通过定量 RT-PCR 和免疫组织化学分析 TLRs 网络（mRNA 定量和蛋白质分布）；
3. 评估巨噬细胞、树突细胞、浸润淋巴细胞的活化状态评估表面标志物（即）和细胞内细胞因子模式（即 TNF、IFN、IL4、IL10）通过细胞荧光分析。 两个活组织检查将进行温和的酶消化，然后用针对表面抗原或细胞内细胞因子的适当标记的抗体染色。

粘膜抗微生物活性。 为了表征袋粘膜中负责形成粘附微生物群的抗菌肽网络，我们将 a) 通过进行体外抗菌毒性试验来确定粘膜提取物的抗菌特性 [37]； b) 通过定量 RT-PCR 量化上皮和白细胞衍生的抗微生物防御素（如 Def2、Def3；DEFA5；DEFA6）。

组织学评估：

对于常规组织学检查，两个活检组织将在 4% PFA 中固定 24 小时，然后脱水并包埋在石蜡中，切下切片（5 μm 厚）并进行标准苏木精/曙红 (H&E) 染色。 为了量化炎症的严重程度，将使用 Floren 等人。得分[41]。

全身和肠道炎症评估

将在每个实验时间线评估全身和局部炎症状态：分别通过红细胞沉降率 (ESR)、白细胞计数 (WBC)、血小板计数 (PLT)、CRP 和粪便乳铁蛋白。 ESR 将通过 Westergren 方法测量。 CRP 将通过免疫比浊法检测（正常：<6 mg/l；病理 >6mg/l）。 总蛋白和白蛋白将用缩二脲法评估。 WBC、血小板计数和血红蛋白血症将通过标准全血细胞计数获得。 粪便乳铁蛋白将通过 ELISA 测试进行给药，该测试使用对冷冻粪便样本上的人乳铁蛋白特异的兔多克隆抗体。

统计分析

将使用 Windows Microsoft Excel 和 Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) 软件进行统计分析。 连续数据将表示为中位数（范围）；二分法数据将表示为频率和比例。 将使用非参数测试。 细菌菌株与炎症参数之间的相关性将通过 Spearman 检验计算，以评估每个菌株的病因致病作用。 相关相关系数将不低于 0.50，并且将双尾统计显着性水平设置为 0.05，功效为 0.20，因此样本量必须至少为 29 名患者。 储袋炎与健康储袋之间的比较将通过 Mann-Whitney U 检验进行。 将统计显着性水平设置为 0.05，将功效设置为 0.20，则比较所需的后续样本量将为每组 16 名患者。 总之，至少有 32 名患者将参加这项研究。 统计显着性将设置为 p<0.05。