Mikrobiota og immunmikromiljø i pouchitt (MEP1)

Studiemål

Arbeidshypotesen er at en forstyrrelse av tarmmikrobiotahomeostase, enten spontan eller forårsaket av deregulering av det medfødte immunitetsmaskineriet i poseslimhinnen, bidrar til utbruddet av kronisk/tilbakefallende pouchitt. Tatt i betraktning at bakteriell kolonisering av poseslimhinnen ideelt sett kan studeres siden genereringen, kan dette betraktes som en ideell modell for å studere samspillet mellom tarmmikrobiota og medfødt immunsystem. Derfor er målet for denne forskningsenheten å etablere hvordan dysbiose og medfødt immunitetsmaskineri dysfunksjon etableres og hvordan denne funksjonssvikten bidrar til utbruddet og vedlikeholdet av pouchitt. For å løse disse relevante patofysiologiske problemene i lys av deres terapeutiske implikasjoner, planlegger vi å utføre en randomisert dobbeltblind studie av probiotika vs placebo hos pasienter som vil gjennomgå kolektomi og påfølgende ileal pouch-anal anastomose for å registrere pasientene ved tidspunktet for ileostomifarge til :

1. evaluere sammensetningen og patogene egenskapene til mikrobiotaen som koloniserer poseslimhinnen etter ileostomi-lukking;
2. bestemme hvordan ekspresjon og aktiveringsstatus for det medfødte immunsystemet i forskjellige celletyper og anatomiske distrikter i poseslimhinnen forholder seg til ileostomilukking;
3. følge opp det kliniske resultatet av analposer i lys av mikrobiota-medfødt immunsystemsamspill.

Studiedesign I løpet av en toårsperiode beregnet vi å inkludere minst 32 pasienter som vil bli randomisert ved ileostomiavslutning i en gruppe som får placebo (16 pasienter) og i en gruppe som får lactobacillus casei GD oralt tilskudd i 8 uker (16 pasienter). Slimhinneprøver vil bli høstet ved ileostomilukking og ved poseendoskopi ved 8 uker og 12 måneder. Vi vil vurdere kvalifiserte kandidater alle pasienter med UC som vil gjennomgå restorativ proktokolektomi med ileal pouch anal anastomose og som vil gå på vår poliklinikk og rutinemessig endoskopisk klinikk. klinisk oppfølging. Pasienter med cuffitt (betennelse i endetarmsslimhinneresten) eller Crohns sykdom i posen (med perianale fistler eller med betennelse i det afferente ileale lem), samt pasienter som vil ha fått antibiotika- eller probiotisk behandling i løpet av de siste 30 dagene ekskludert fra studien. Pasienter med PDAI>7 vil bli vurdert som åpen posebetennelse. Protokollen vil være i samsvar med prinsippene i den endrede Helsinki-erklæringen.

Hver pasient vil få detaljert informasjon om studiens mål og metodikk og vil bli bedt om å gi skriftlig, informert samtykke før påmelding. I denne perioden vil pasienter bli bedt om å gjennomgå poseendoskopi med slimhinnebiopsier, avføring og blodprøvetaking ved tre påfølgende tidspunkt: a) før ileostomilukking, b) 2 måneder etter ileostomilukking, c) 12 måneder etter ileostomilukking (eller før, i tilfelle av åpen posebetennelse). Basert på kliniske, endoskopiske og histologiske kriterier og PDAI vil vi vurdere sykdommens alvorlighetsgrad [5]. Basert på histologisk og endoskopisk akutt betennelse samt kliniske symptomer, vil pasienter med en total PDAI >7 bli klassifisert som akutt pouchitt.

Endoskopi av posen vil bli utført uten sedasjon. Den afferente løkken, posen vil bli nøye undersøkt og biopsiprøvetaking vil bli utført: to prøver for mikrobiotakarakterisering, to for konvensjonell histologi, fire for molekylærbiologi og cytofluorimetrisk analyse. Biopsier vil bli håndtert og lagret i henhold til de forskjellige studiene.

Mikrobiotavurdering:

For å karakterisere bakterier som fester seg til posens slimhinne, vil biopsier fra ileal-posen enten vaskes forsiktig for å fjerne løst vedheftende mikrober og deretter fryses ned i flytende nitrogen for påfølgende DNA-ekstraksjon, eller plasseres i tioglykolatmedium for å bevare anaerobe mikrober for påfølgende kulturer.

Relativ forekomst av bakteriefyla i fekale prøver vil bli estimert ved å sekvensere PCR-amplikonene som er målrettet mot 16S rRNA-genet for DNA-prøvene som er ekstrahert fra hver avføringsprøve. PCR vil bli utført ved å bruke primersettet (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' og 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3') som retter seg mot V5-V6-regionen til 16S rRNA-genene [38]. For å amplifisere målregionen vil 1 μl ekstrahert DNA tjene som mal i 50 μl reaksjoner ved bruk av Prime STAR HS premix (Takara Bio Inc., Japan). Produkter fra de to rekondisjonerings-PCR-reaksjonene per prøve vil bli kombinert og renset ved bruk av QIAquick PCR-rensekolonner (Qiagen). De amplifiserte PCR-produktene vil bli brukt som en mal for pyrosekvensering med GS Junior-plattformen (454 Life Sciences). Pyrosekvensering vil bli utført ved å følge produsentens instruksjoner ved å bruke MID-tagger. Vi forventer å oppnå omtrent 15 000 sekvenser for hver prøve i gjennomsnitt. De innhentede dataene vil bli gjenstand for en dataanalyse utført av beregningsverktøy. Bakteriell rRNA-typing vil bli utført ved BLASTN-søk mot den omfattende rRNA-databasen "silva" release 94 [39] ved bruk av en terskel på E-verdi <1E-40. Alle bakteriearter oppnådd fra hver avføringsprøve vil bli klassifisert i deres fylogenetiske grupper og andelen av forskjellige fyla vil bli estimert. Estimeringen av operasjonell taksonomisk enhet (OTU) vil bli utført av programmet ESPRIT ved å bruke standardinnstillinger [40].

For mikrobiologiske kulturer vil biopsier umiddelbart plassert i tioglykolatmedium (for å beskytte anaerobe mikrober mot oksygeneksponering) bli manipulert videre i en anaerob hette fylt med C02:H2 (95:5) atmosfære. Biopsier vil bli vasket i steril fargegasset saltløsning supplert med 0,016 % ditioerytritol for å fjerne slimet og etter cellehypotonisk lysis i sterilt vann, sås i riktige agarplater for å evaluere den overfladiske mikrofloraen. [35]. Prøver vil bli sådd på ikke-selektive (Brain Heart Infusion Agar, BHA) og selektive medier for Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) og Lactobacillus spp (Rogosa SL agar).

BHA- og MacConkey-agarplater vil bli dyrket under anaerobe og aerobe forhold (henholdsvis 24 og 72 timer), mens Rogosa SL-agarplater kun dyrkes under anaerobe forhold (72 timer) ved 37 °C. Kolonier vil bli talt, gruppert på grunnlag av morfologisk utseende og underkastet morfologisk analyse ved Gram-farging (Biolife S.r.l.). Deretter vil mikrober bli utsatt for molekylær karakterisering, utført ved sekvensering av PCR-amplikoner av 16S rRNA ved bruk av et "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Isolater vil bli ytterligere karakterisert i henhold til deres patogenisitetspotensial (dvs. toksigen profil og antibiotikaresistens).

Slimhinnen medfødt immunmiljø

Analyse av det inflammatoriske nettverket i poseslimhinnen vil inkludere

1. kvantifisering av cytokiner [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 og IL-4 og kjemokiner [MCP1,] nivå ved Bio-Plex cytokin immunoassay. En biopsi vil bli homogenisert og den klare supernatanten brukes til moderne kvantifisering av flere cytokiner og kjemokiner ved spesialdesignede analyser;
2. analyse av TLR-nettverk (mRNA kvantifisering og proteindistribusjon) ved henholdsvis kvantitativ RT-PCR og immunhistokjemi;
3. vurdering av aktiveringsstatus for makrofager, dendrittiske celler, infiltrerende lymfocytter som evaluerer overflatemarkører (dvs.) og intracellulært cytokinmønster (dvs. TNF, IFN, IL4, IL10) ved cytofluorimetrisk analyse. To biopsier vil bli utsatt for skånsom enzymatisk fordøyelse og deretter farget med riktig merkede antistoffer rettet mot overflateantigener eller intracellulære cytokiner.

Slimhinne antimikrobiell aktivitet. For å karakterisere det antibakterielle peptidnettverket i poseslimhinnen som er ansvarlig for å forme den adherente mikrobiotaen, vil vi a) bestemme de antimikrobielle egenskapene til slimhinneekstrakter ved å utføre in vitro antibakteriell toksisitetsanalyse [37]; b) kvantifisere epitel- og leukocyttavledede antimikrobielle defensiner (som Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) ved kvantitativ RT-PCR.

Histologisk vurdering:

For rutinemessig histologisk undersøkelse vil to biopsier bli fiksert i 4 % PFA i 24 timer, deretter dehydrert og innebygd i parafin, og snitt (5 μm tykke) vil bli kuttet og utsatt for standard hematoxylin/eosin (H&E)-farging. For å kvantifisere inflammatorisk alvorlighetsgrad vil Floren et al. score [41].

Systemisk og tarmbetennelsesvurdering

Systemisk og lokal inflammatorisk tilstand vil bli vurdert ved hver eksperimentell tidslinje ved: henholdsvis erytrocyttsedimentasjonshastighet (ESR), antall hvite blodlegemer (WBC), antall blodplater (PLT), CRP og fekal laktoferrin. ESR vil bli målt med Westergren-metoden. CRP vil bli påvist ved immunnefelometri (normal: <6 mg/l; patologisk >6mg/l). Totalt protein og albumin vil bli vurdert med biuretmetoden. WBC, antall blodplater og hemoglobinemi vil bli oppnådd med standard fullt antall blodceller. Fekal laktoferrin vil bli dosert ved en ELISA-test som bruker polyklonale kaninantistoffer spesifikke for humant laktoferrin på frosne avføringsprøver.

Statistisk analyse

Statistisk analyse vil bli utført ved hjelp av Windows Microsoft Excel og en programvare for Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Kontinuerlige data vil bli uttrykt som median (område); dikotomiske data vil bli uttrykt som frekvens og proporsjon. Ikke-parametriske tester vil bli brukt. Korrelasjon mellom bakteriestammer og inflammatoriske parametere vil bli beregnet med Spearman test for å evaluere den etio-patogenetiske rollen til hver stamme. Relevant korrelasjonskoeffisient vil ikke være dårligere enn 0,50, og ved å sette et statistisk signifikansnivå med to haler til 0,05 og kraft til 0,20, vil den påfølgende prøvestørrelsen måtte være minst 29 pasienter. Sammenligning mellom pouchitis og sunn pouch vil bli utført med Mann-Whitney U-test. Sett et nivå av statistisk signifikans til 0,05 og en potens til 0,20, den påfølgende prøvestørrelsen som kreves for sammenligning vil være 16 pasienter for hver gruppe. Avslutningsvis vil minst 32 pasienter bli registrert i denne studien. Statistisk signifikans vil bli satt til p<0,05.