嚢炎における微生物叢と免疫微小環境 (MEP1)

研究の目的

作業仮説は、自発的または嚢粘膜内の自然免疫機構の規制緩和によって引き起こされる腸内微生物叢の恒常性の崩壊が、慢性/再発性嚢炎の発症に寄与するというものです。 ポーチ粘膜の細菌のコロニー形成は、その世代から理想的に研究できることを考慮すると、これは腸内微生物叢と自然免疫系の間の相互作用を研究するための理想的なモデルと見なすことができます。 したがって、この研究ユニットの目標は、腸内細菌叢と自然免疫機構の機能不全がどのように確立され、この機能不全が嚢炎の発症と維持にどのように寄与するかを明らかにすることです。 これらの関連する病態生理学的問題を治療上の意味合いに照らして対処するために、結腸切除術とその後の回腸嚢肛門吻合術を受ける患者を対象に、プロバイオティクスとプラセボを比較するランダム化二重盲検試験を実施し、回腸造瘻術の時点で患者を登録する予定です。 :

1. 回腸瘻閉鎖後に嚢粘膜にコロニーを形成する微生物叢の組成と病原性を評価します。
2. さまざまな細胞型および嚢粘膜の解剖学的領域における自然免疫系の発現および活性化状態が回腸造瘻閉鎖にどのように関連しているかを決定します。
3. 微生物叢と自然免疫系の相互作用に照らして、肛門嚢の臨床結果を追跡します。

研究デザイン 2 年間で、回腸瘻閉鎖時に無作為に割り付けられる少なくとも 32 人の患者を登録する計算を行いました。 粘膜サンプルは、回腸造瘻閉鎖時および 8 週目および 12 か月目の嚢内視鏡検査時に採取されます。回腸嚢肛門吻合を伴う修復的直腸結腸切除術を受け、定期的な内視鏡およびルーチン検査のために外来診療所に通うすべての UC 患者を適格な候補者と見なします。臨床フォローアップ。 -カフ炎（直腸粘膜の炎症）または嚢のクローン病（肛門周囲瘻または求心性回腸肢の炎症を伴う）の患者、および抗生物質またはプロバイオティクス療法を過去30日間受けた患者は、研究から除外。 PDAIが7を超える患者は、明白な嚢炎と見なされます。 プロトコルは、修正されたヘルシンキ宣言の原則に準拠します。

各患者には、研究の目的と方法論に関する詳細な情報が提供され、登録前に書面によるインフォームドコンセントを提供するよう求められます。 この期間中、患者は、粘膜生検、糞便および血液のサンプリングを伴うパウチ内視鏡検査を受けるように求められます。a) 回腸瘻閉鎖前、b) 回腸瘻閉鎖の 2 か月後、c) 回腸瘻閉鎖の 12 か月後 (または明らかな嚢炎の場合）。 臨床的、内視鏡的および組織学的基準とPDAIに基づいて、疾患の重症度を評価します[5]。 組織学的および内視鏡的急性炎症、ならびに臨床症状に基づいて、合計PDAIが7を超える患者は、急性嚢炎を有すると分類されます。

パウチの内視鏡検査は鎮静なしで行われます。 求心性ループ、ポーチが慎重に検査され、生検サンプリングが実行されます: 微生物叢の特徴付けのための 2 つのサンプル、従来の組織学のための 2 つ、分子生物学および細胞蛍光分析のための 4 つのサンプル。 生検は、さまざまな研究に応じて処理および保存されます。

微生物叢の評価:

ポーチ粘膜生検に付着した細菌を特徴付けるには、回腸ポーチからの生検をすぐに穏やかに洗浄して緩く付着した微生物を除去し、その後の DNA 抽出のために液体窒素で凍結するか、またはその後の培養のために嫌気性微生物を保存するためにチオグリコレート培地に入れます。

糞便標本中の細菌門の相対的存在量は、各糞便標本から抽出された DNA サンプルの 16S rRNA 遺伝子をターゲットとする PCR アンプリコンを配列決定することによって推定されます。 PCR は、16S rRNA 遺伝子の V5-V6 領域をターゲットとするプライマー セット (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' および 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3') を使用して実行されます [38]。 標的領域を増幅するために、抽出された DNA 1 μl は、Prime STAR HS premix (Takara Bio Inc.、日本) を使用した 50 μl 反応のテンプレートとして機能します。 試料あたり２回のリコンディショニングＰＣＲ反応の産物を合わせ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。 増幅された PCR 産物は、GS Junior プラットフォーム (454 Life Sciences) によるパイロシーケンシングのテンプレートとして使用されます。 パイロシーケンシングは、MID タグを使用して製造元の指示に従って実行されます。 平均して、各サンプルで約 15,000 のシーケンスを取得できると予想しています。 得られたデータは、計算ツールによって実行されるデータ分析にかけられます。 細菌のrRNAタイピングは、E値<1E-40の閾値を使用して、包括的なrRNAデータベース「silva」リリース94 [39]に対するBLASTN検索によって実行されます。 各糞便サンプルから得られたすべての細菌種は、それらの系統群に分類され、異なる門の割合が推定されます。 運用分類単位 (OTU) の推定は、デフォルト設定 [40] を使用してプログラム ESPRIT によって実行されます。

微生物培養の場合、チオグリコレート培地（嫌気性微生物を酸素暴露から保護するため）に直ちに配置された生検は、C02：H2（95：5）雰囲気で満たされた嫌気性フードでさらに操作されます。 生検材料は、粘液を除去するために 0.016% ジチオエリスリトールを添加した無菌の染料ガス処理生理食塩水で洗浄し、無菌水中で細胞の低張溶解を行い、適切な寒天プレートに播種して表面微生物フローラを評価します。 [35]。 サンプルは、非選択的 (Brain Heart Infusion Agar、BHA) および腸内細菌属 (MacConkey agar) および Lactobacillus spp (Rogosa SL agar) の選択培地に播種されます。

BHA および MacConkey 寒天プレートは、嫌気的および好気的条件 (それぞれ 24 時間および 72 時間) で培養されますが、Rogosa SL 寒天プレートは、37°C​​ で嫌気的条件 (72 時間) でのみ培養されます。 コロニーを計数し、形態学的外観に基づいてグループ化し、グラム染色 (Biolife S.r.l.) による形態学的分析にかける。 次に、微生物は、「Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit」を使用して 16S rRNA の PCR アンプリコンのシーケンシングによって実行される分子特性解析に供されます [24]。 分離株は、その病原性の可能性に従ってさらに特徴付けられます（つまり、 毒性プロファイルおよび抗生物質耐性)。

粘膜の自然免疫環境

嚢粘膜の炎症ネットワークの分析には、

1. Bio-Plexサイトカインイムノアッセイによるサイトカイン[IL-1β、IL-6、TNF-β、TGFβ、IL-10、IL-4およびケモカイン[MCP1]レベルの定量。 1 つの生検はホモジネートされ、透明な上清は、カスタム設計されたアッセイによる複数のサイトカインおよびケモカインの現代的な定量化に使用されます。
2. それぞれ定量的RT-PCRおよび免疫組織化学によるTLRネットワークの分析（mRNA定量およびタンパク質分布）。
3. マクロファージ、樹状細胞、浸潤性リンパ球の活性化状態の評価、表面マーカー (すなわち) および細胞内サイトカイン パターン (すなわち TNFα、IFNα、IL4、IL10) 細胞蛍光分析による。 2 つの生検は穏やかな酵素消化にさらされ、表面抗原または細胞内サイトカインに対する適切に標識された抗体で染色されます。

粘膜抗菌活​​性。 付着性微生物叢の形成に関与するポーチ粘膜の抗菌ペプチドネットワークを特徴付けるために、a) in vitro 抗菌毒性アッセイを実行することにより、粘膜抽出物の抗菌特性を決定します [37]。 b) 上皮および白血球由来の抗菌ディフェンシン (Def2、Def3; DEFA5; DEFA6 など) を定量的 RT-PCR により定量化します。

組織学的評価:

ルーチンの組織学的検査では、2 つの生検材料を 4% PFA で 24 時間固定し、脱水してパラフィンに包埋し、切片 (厚さ 5 μm) を切り取り、標準的なヘマトキシリン/エオシン (H&E) 染色にかけます。 炎症の重症度を定量化するために、フローレンらが使用されます。スコア [41]。

全身および腸の炎症評価

全身および局所の炎症状態は、各実験タイムラインで、赤血球沈降速度（ESR）、白血球数（WBC）、血小板血球数（PLT）、CRP、および糞便ラクトフェリンによってそれぞれ評価されます。 ESRはWestergren法によって測定されます。 CRPは、免疫比濁法によって検出されます（正常：<6 mg / l;病理学的> 6 mg / l）。 総タンパク質とアルブミンは、ビウレット法で評価されます。 WBC、血小板数、およびヘモグロビン血症は、標準的な全血球数で取得されます。 糞便ラクトフェリンは、凍結糞便サンプル上のヒトラクトフェリンに特異的なウサギポリクローナル抗体を使用するELISA試験によって投与されます。

統計分析

統計分析は、Windows Microsoft Excel および Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) ソフトウェアを使用して実行されます。 連続データは中央値 (範囲) として表されます。二分データは、頻度と割合として表されます。 ノンパラメトリック検定が使用されます。 細菌株と炎症パラメータとの間の相関関係は、Spearman テストを使用して計算され、各株の病因病原性の役割が評価されます。 関連する相関係数は 0.50 に劣らず、両側統計の有意水準を 0.05、検出力を 0.20 に設定すると、結果として得られるサンプル サイズは少なくとも 29 人の患者である必要があります。 嚢炎と健康な嚢との比較は、マン・ホイットニーの U 検定で行います。 統計的有意水準を 0.05 に設定し、検出力を 0.20 に設定すると、結果として比較に必要なサンプル サイズは、各グループで 16 人の患者になります。 結論として、少なくとも32人の患者がこの研究に登録されます。 統計的有意性は、p<0.05 に設定されます。