Mikrobióta és immun mikrokörnyezet Pouchitisben (MEP1)

Tanulmányi célok

A munkahipotézis az, hogy a bél mikrobiota homeosztázisának akár spontán, akár a tasak nyálkahártyáján belüli veleszületett immunrendszer deregulációja által okozott zavara hozzájárul a krónikus/relapszáló pouchitis kialakulásához. Figyelembe véve, hogy a tasak nyálkahártyájának bakteriális kolonizációja ideálisan tanulmányozható a keletkezésétől kezdve, ez ideális modellnek tekinthető a bélmikrobióta és a veleszületett immunrendszer közötti kölcsönhatás tanulmányozására. Ezért ennek a kutatási egységnek az a célja, hogy feltárja, hogyan jön létre a dysbiosis és a veleszületett immunrendszeri zavarok, és hogyan járul hozzá ez a diszfunkció a pouchitis kialakulásához és fenntartásához. E releváns patofiziológiai problémák terápiás vonatkozásaik fényében történő megoldása érdekében azt tervezzük, hogy randomizált kettős vak vizsgálatot végzünk probiotikumokkal és placebóval olyan betegeknél, akiknél kolektómián és ezt követően ilealis pouch-analis anasztomózison esnek át, hogy a betegeket az ileostoma elszíneződésének időpontjában bevonjuk. :

1. értékeli a tasak nyálkahártyáját megtelepedő mikrobióta összetételét és patogén tulajdonságait az ileostomia lezárása után;
2. annak meghatározása, hogy a veleszületett immunrendszer expressziós és aktivációs állapota a különböző sejttípusokban és a tasak nyálkahártyájának anatómiai körzeteiben hogyan kapcsolódik az ileostomia zárásához;
3. az anális tasakok klinikai kimenetelének nyomon követése a mikrobiota és a veleszületett immunrendszer kölcsönhatásának fényében.

A vizsgálat felépítése Egy kétéves periódusban úgy számoltunk, hogy legalább 32 beteget vonunk be, akiket az ileostoma lezárásakor véletlenszerűen besorolunk egy placebót kapó csoportba (16 beteg) és egy olyan csoportba, amely 8 hétig lactobacillus casei GD orális kiegészítést kapott (16 beteg). A nyálkahártya-mintákat az ileostoma lezárásakor és a tasak endoszkópiájánál 8 hetes és 12 hónapos korban gyűjtjük. Minden olyan UC-s beteget megfelelő jelöltnek tekintünk, akinél resztoratív proctocolectomián esik át ileális tasak anális anasztomózissal, és akik ellátogatnak járóbeteg-klinikánkra rutin endoszkópos és endoszkópos vizsgálatra. klinikai követés. Cuffitisben (rektális nyálkahártya-maradvány gyulladása) vagy Crohn-betegségben szenvedő betegeknél (perianalis sipolyok vagy az afferens csípőbéli végtag gyulladása esetén), valamint azok a betegek, akik az elmúlt 30 nap során antibiotikum- vagy probiotikus kezelésben részesültek. kizárták a vizsgálatból. A 7-nél nagyobb PDAI-ban szenvedő betegek nyilvánvaló pouchitisnek minősülnek. A jegyzőkönyv megfelel a módosított Helsinki Nyilatkozat elveinek.

Minden páciens részletes tájékoztatást kap a vizsgálat céljairól és módszertanáról, és írásos, tájékozott beleegyezését kérik a felvétel előtt. Ebben az időszakban a betegeket tok endoszkópiának kell alávetni nyálkahártya biopsziával, széklet- és vérmintával az alábbi három időpontban: a) az ileostoma lezárása előtt, b) 2 hónappal az ileostoma lezárása után, c) 12 hónappal az ileostoma lezárása után (vagy előtte, nyilvánvaló pouchitis esetén). Klinikai, endoszkópos és szövettani kritériumok, valamint a PDAI alapján értékeljük a betegség súlyosságát [5]. A szövettani és endoszkópos akut gyulladás, valamint a klinikai tünetek alapján a 7-nél nagyobb össz-PDAI-val rendelkező betegek akut pouchitisben szenvedőknek minősülnek.

A tasak endoszkópiáját szedáció nélkül végzik el. Az afferens hurkot, a tasakot gondosan megvizsgálják, és biopsziás mintát vesznek: két mintát a mikrobiota jellemzésére, kettőt a hagyományos szövettanra, négyet a molekuláris biológiára és a citofluorimetriás elemzésre. A biopsziákat a különböző vizsgálatoknak megfelelően kezelik és tárolják.

Mikrobióta felmérés:

A tasak nyálkahártyájához tapadt baktériumok jellemzésére a csípőbél tasakból származó biopsziákat vagy azonnal óvatosan lemossák, hogy eltávolítsák a lazán megtapadt mikrobákat, majd folyékony nitrogénben lefagyasztják a későbbi DNS-kivonáshoz, vagy tioglikolát táptalajba helyezik, hogy megőrizzék az anaerob mikrobákat a következő tenyészetekhez.

A bélsárminták bakteriális törzsének relatív abundanciáját a 16S rRNS gént megcélzó PCR-amplikonok szekvenálásával becsüljük meg az egyes székletmintákból kivont DNS-mintákban. A PCR-t a 16S rRNS gének V5-V6 régióját célzó primerkészlettel (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ és 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′) hajtják végre [38]. A megcélzott régió amplifikálásához 1 μl extrahált DNS szolgál templátként 50 μl-es reakciókban Prime STAR HS premix (Takara Bio Inc., Japán) használatával. A két helyreállító PCR-reakció termékeit mintánként egyesítjük és QIAquick PCR tisztító oszlopokkal (Qiagen) tisztítjuk. Az amplifikált PCR-termékeket sablonként fogják használni a GS Junior platformon (454 Life Sciences) végzett piroszekvenáláshoz. A piroszekvenálást a gyártó utasításait követve, MID címkék használatával hajtják végre. Átlagosan körülbelül 15 000 szekvenciát várunk minden mintához. A kapott adatokat számítástechnikai eszközökkel végzett adatelemzésnek vetik alá. A bakteriális rRNS tipizálást a BLASTN kereséssel hajtják végre az átfogó "silva" 94-es kiadású rRNS adatbázissal [39], az E-érték <1E-40 küszöbértékével. Az egyes székletmintákból nyert összes baktériumfajt filogenetikai csoportjukba soroljuk, és megbecsüljük a különböző törzsek arányát. Az operatív taxonómiai egység (OTU) becslését az ESPRIT program végzi el az alapértelmezett beállításokkal [40].

Mikrobiológiai tenyészeteknél az azonnal tioglikolát táptalajba helyezett biopsziákat (az anaerob mikrobák oxigénexpozíció elleni védelme érdekében) tovább manipulálják egy C02:H2 (95:5) atmoszférával töltött anaerob burkolatban. A biopsziákat steril festékkel gázosított sóoldattal mossuk, amelyet 0,016%-os ditioeritrittel egészítünk ki a nyálka eltávolítása érdekében, majd a sejt hipotóniás lízisét követően steril vízben, megfelelő agarlemezekre oltjuk a felületes mikroflóra értékelésére. [35]. A mintákat nem szelektív (Brain Heart Infusion Agar, BHA) és Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) és Lactobacillus spp (Rogosa SL agar) szelektív táptalajokra oltják.

A BHA- és MacConkey-agarlemezeket anaerob és aerob körülmények között (24, illetve 72 óra), míg a Rogosa SL agarlemezeket csak anaerob körülmények között (72 óra) 37 °C-on tenyésztjük. A telepeket megszámlálják, morfológiai megjelenésük alapján csoportosítják, és Gram-festéssel (Biolife S.r.l.) morfológiai elemzésnek vetik alá. Ezután a mikrobákat molekuláris jellemzésnek vetik alá, amelyet a 16S rRNS PCR-amplikonjainak szekvenálásával hajtanak végre egy "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24] segítségével. Az izolátumokat tovább jellemezzük patogenitási potenciáljuk alapján (pl. toxigén profil és antibiotikum-rezisztencia).

Nyálkahártya veleszületett immunkörnyezet

A tasak nyálkahártyájának gyulladásos hálózatának elemzése magában foglalja

1. citokinek [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 és IL-4, valamint kemokinek [MCP1,] szintjének mennyiségi meghatározása Bio-Plex citokin immunoassay segítségével. Egy biopsziát homogenizálunk, és a tiszta felülúszót többszörös citokin és kemokin kortárs mennyiségi meghatározására használjuk fel egyedi tervezésű tesztekkel;
2. a TLR-hálózat elemzése (mRNS mennyiségi meghatározása és fehérjeeloszlás) kvantitatív RT-PCR-rel, illetve immunhisztokémiával;
3. makrofágok, dendritikus sejtek, infiltráló limfociták aktivációs állapotának felmérése, felszíni markerek (azaz) és intracelluláris citokinek mintázata (pl. TNF, IFN, IL4, IL10) citofluorimetriás analízissel. Két biopsziát enyhe enzimatikus emésztésnek vetünk alá, majd megfelelően jelölt antitestekkel festjük, amelyek felszíni antigének vagy intracelluláris citokinek ellen irányulnak.

Nyálkahártya antimikrobiális aktivitása. A tapadó mikrobióta kialakításáért felelős tasak nyálkahártyájában található antibakteriális peptid-hálózat jellemzésére a) meghatározzuk a nyálkahártya-kivonatok antimikrobiális tulajdonságait in vitro antibakteriális toxicitási vizsgálattal [37]; b) kvantitatív RT-PCR segítségével számszerűsítse az epiteliális és leukocitákból származó antimikrobiális defenzineket (például Def2, Def3; DEFA5; DEFA6).

Szövettani értékelés:

A rutin szövettani vizsgálathoz két biopsziát rögzítenek 4%-os PFA-ban 24 órán át, majd dehidratálják és paraffinba ágyazzák, majd metszeteket (5 μm vastag) vágnak le, és standard hematoxilin/eozin (H&E) festésnek vetik alá. A gyulladás súlyosságának számszerűsítésére Floren et al. pontszám [41].

Szisztémás és bélgyulladás felmérése

A szisztémás és a lokális gyulladásos állapotot minden kísérleti idővonalon értékelni fogják a következők szerint: vörösvértest-süllyedés (ESR), fehérvérsejtszám (WBC), vérlemezke-vérszám (PLT), CRP és széklet laktoferrin. Az ESR mérése a Westergren módszerrel történik. A CRP-t immun-nefelometriával lehet kimutatni (normál: <6 mg/l; patológiás >6 mg/l). Az összes fehérjét és albumint a biuret módszerrel kell értékelni. A fehérvérsejtszámot, a vérlemezkeszámot és a hemoglobinémiát standard teljes vérsejtszámmal határozzák meg. A széklet laktoferrin adagolása ELISA-teszttel történik, amely humán laktoferrinre specifikus nyúl poliklonális antitesteket használ fagyasztott székletmintákon.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzés a Windows Microsoft Excel és a Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) szoftver segítségével történik. A folyamatos adatok mediánban (tartományban) lesznek kifejezve; a dichotómiás adatokat gyakoriságban és arányban fejezzük ki. Nem paraméteres teszteket használnak. A baktériumtörzsek és a gyulladásos paraméterek közötti összefüggést Spearman teszttel számítjuk ki, hogy értékeljük az egyes törzsek etio-patogenetikai szerepét. A releváns korrelációs együttható nem lesz alacsonyabb 0,50-nél, és ha a kétvégű statisztikai szignifikancia szintet 0,05-re, a teljesítményt pedig 0,20-ra állítjuk, a minta ebből következő nagyságának legalább 29 betegből kell állnia. A pouchitis és az egészséges tasak összehasonlítása Mann-Whitney U teszttel történik. Állítsa be a statisztikai szignifikancia szintjét 0,05-re és a hatványt 0,20-ra, az összehasonlításhoz szükséges ebből következő mintanagyság 16 beteg lesz minden csoportban. Összefoglalva, legalább 32 beteget vonnak be ebbe a vizsgálatba. A statisztikai szignifikancia értéke p<0,05 lesz.