Микробиота и иммунная микросреда при поухите (MEP1)

Цели исследования

Рабочая гипотеза состоит в том, что нарушение гомеостаза кишечной микробиоты, либо спонтанное, либо вызванное нарушением регуляции механизма врожденного иммунитета в слизистой оболочке резервуара, способствует возникновению хронического/рецидивирующего поухита. Принимая во внимание, что бактериальная колонизация слизистой оболочки кармана может быть идеально изучена с момента ее образования, это можно рассматривать как идеальную модель для изучения взаимодействия между микробиотой кишечника и врожденной иммунной системой. Таким образом, цель этого исследовательского подразделения состоит в том, чтобы установить, как дисбактериоз и дисфункция механизма врожденного иммунитета устанавливаются и как эта дисфункция способствует возникновению и поддержанию поухита. Чтобы решить эти важные патофизиологические проблемы в свете их терапевтических последствий, мы планируем провести рандомизированное двойное слепое исследование пробиотиков по сравнению с плацебо у пациентов, которым предстоит колэктомия и последующий подвздошно-анальный анастомоз. :

1. оценить состав и патогенные свойства микробиоты, колонизирующей слизистую оболочку резервуара после закрытия илеостомы;
2. определить, как экспрессия и статус активации системы врожденного иммунитета в различных типах клеток и анатомических областях слизистой оболочки кармана связаны с закрытием илеостомы;
3. проследить клинический исход анальных мешочков в свете взаимодействия микробиоты и врожденной иммунной системы.

Дизайн исследования. Мы рассчитали, что за двухлетний период мы включим не менее 32 пациентов, которые будут рандомизированы при закрытии илеостомы в группу, получающую плацебо (16 пациентов), и в группу, получающую пероральные добавки Lactobacillus casei GD в течение 8 недель (16 пациентов). Образцы слизистой оболочки будут собираться при закрытии илеостомы и при эндоскопии резервуара через 8 недель и 12 месяцев. Мы будем рассматривать подходящих кандидатов для всех пациентов с ЯК, которым предстоит восстановительная проктоколэктомия с анастомозом подвздошного резервуара и которые будут посещать нашу амбулаторную клинику для рутинной эндоскопии и эндоскопии. клиническое сопровождение. Пациентам с куффитом (воспалением остатка слизистой оболочки прямой кишки) или болезнью Крона резервуара (с перианальными свищами или с воспалением приводящей подвздошной ветви), а также пациентам, получавшим антибиотикотерапию или пробиотическую терапию в течение предшествующих 30 дней, исключены из исследования. Пациенты с PDAI>7 будут рассматриваться как явный поухит. Протокол будет соответствовать принципам исправленной Хельсинкской декларации.

Каждому пациенту будет предоставлена ​​подробная информация о целях и методологии исследования, и его попросят дать письменное информированное согласие до включения в исследование. В течение этого периода пациентам будет предложено пройти эндоскопию мешка с биопсией слизистой, забором кала и крови в три следующих периода времени: а) до закрытия илеостомы, б) через 2 месяца после закрытия илеостомы, в) через 12 месяцев после закрытия илеостомы (или до, в случае явного поухита). На основании клинических, эндоскопических и гистологических критериев и PDAI мы будем оценивать тяжесть заболевания [5]. На основании гистологического и эндоскопического острого воспаления, а также клинических симптомов пациенты с общим PDAI> 7 будут классифицироваться как имеющие острый поухит.

Эндоскопия резервуара будет проводиться без седации. Приводящая петля, резервуар будут тщательно исследованы, после чего будут взяты биоптаты: два образца для характеристики микробиоты, два для традиционной гистологии, четыре для молекулярной биологии и цитофлуориметрического анализа. Биопсии будут обрабатываться и храниться в соответствии с различными исследованиями.

Оценка микробиоты:

Чтобы охарактеризовать бактерии, прикрепившиеся к резервуару слизистой оболочки, биоптаты из подвздошного резервуара будут либо немедленно осторожно промыты для удаления слабо прикрепленных микробов, а затем заморожены в жидком азоте для последующего выделения ДНК, либо помещены в тиогликолатную среду для сохранения анаэробных микробов для последующих культур.

Относительное обилие типов бактерий в образцах фекалий будет оцениваться путем секвенирования ампликонов ПЦР, нацеленных на ген 16S рРНК, для образцов ДНК, извлеченных из каждого образца фекалий. ПЦР будет проводиться с использованием набора праймеров (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' и 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3'), нацеленных на область V5-V6 генов 16S рРНК [38]. Для амплификации целевой области 1 мкл выделенной ДНК будет служить матрицей в реакциях объемом 50 мкл с использованием премикса Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Япония). Продукты двух рекондиционирующих ПЦР-реакций на образец будут объединены и очищены с использованием колонок для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen). Амплифицированные продукты ПЦР будут использоваться в качестве шаблона для пиросеквенирования на платформе GS Junior (454 Life Sciences). Пиросеквенирование будет выполняться в соответствии с инструкциями производителя с использованием тегов MID. Мы ожидаем получить в среднем около 15 000 последовательностей для каждого образца. Полученные данные будут подвергнуты анализу данных, выполненному вычислительными инструментами. Типирование бактериальной рРНК будет выполняться с помощью поиска BLASTN по комплексной базе данных рРНК «silva», версия 94 [39], с использованием порогового значения E-значения <1E-40. Все виды бактерий, полученные из каждого образца фекалий, будут классифицированы по их филогенетическим группам, и будет оценена пропорция различных типов. Оценка оперативной таксономической единицы (OTU) будет выполнена программой ESPRIT с настройками по умолчанию [40].

Для микробиологических культур биоптаты, немедленно помещенные в тиогликолатную среду (для защиты анаэробных микробов от воздействия кислорода), будут подвергаться дальнейшим манипуляциям в анаэробном боксе, заполненном атмосферой C02:H2 (95:5). Биоптаты будут промываться в стерильном солевом растворе, насыщенном красителем, с добавлением 0,016% дитиоэритрита для удаления слизи и после гипотонического лизиса клеток в стерильной воде, высеянных в соответствующие чашки с агаром для оценки поверхностной микрофлоры. [35]. Образцы будут высеяны на неселективные (агар для инфузии мозга и сердца, BHA) и селективные среды для видов Enterobacteriacae (агар МакКонки) и Lactobacillus spp (агар Rogosa SL).

Чашки с агаром BHA и MacConkey будут культивироваться в анаэробных и аэробных условиях (24 и 72 часа соответственно), тогда как чашки с агаром Rogosa SL будут культивироваться только в анаэробных условиях (72 часа) при 37°C. Колонии будут подсчитаны, сгруппированы на основе морфологического внешнего вида и подвергнуты морфологическому анализу с помощью окрашивания по Граму (Biolife S.r.l.). Затем микробы будут подвергнуты молекулярной характеристике, выполненной путем секвенирования ПЦР-ампликонов 16S рРНК с использованием «Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit» [24]. Изоляты будут дополнительно охарактеризованы в соответствии с их потенциалом патогенности (т.е. токсигенный профиль и устойчивость к антибиотикам).

Врожденная иммунная среда слизистых оболочек

Анализ воспалительной сети в слизистой оболочке кармана будет включать

1. количественное определение уровня цитокинов [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF β, IL-10 и IL-4 и хемокинов [MCP1] с помощью иммуноанализа цитокинов Bio-Plex. Одна биопсия будет гомогенизирована, а прозрачный супернатант будет использован для современного количественного определения множественных цитокинов и хемокинов с помощью специально разработанных анализов;
2. анализ сети TLRs (количественная оценка мРНК и распределение белков) с помощью количественной ОТ-ПЦР и иммуногистохимии соответственно;
3. оценка состояния активации макрофагов, дендритных клеток, инфильтрирующих лимфоцитов, оценка поверхностных маркеров (т.е.) и картины внутриклеточных цитокинов (т.е. TNF, IFN, IL4, IL10) цитофлуориметрическим анализом. Два биоптата будут подвергнуты мягкому ферментативному расщеплению, а затем окрашены должным образом мечеными антителами, направленными против поверхностных антигенов или внутриклеточных цитокинов.

Антимикробная активность слизистых оболочек. Чтобы охарактеризовать антибактериальную пептидную сеть в слизистой оболочке мешочка, отвечающую за формирование прикрепленной микробиоты, мы а) определим антимикробные свойства экстрактов слизистой оболочки, проведя анализ антибактериальной токсичности in vitro [37]; б) количественное определение эпителиальных и лейкоцитарных антимикробных дефенсинов (таких как Def2, Def3, DEFA5, DEFA6) с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Гистологическая оценка:

Для рутинного гистологического исследования две биопсии будут зафиксированы в 4% PFA в течение 24 часов, затем обезвожены и заключены в парафин, а срезы (толщиной 5 мкм) будут вырезаны и подвергнуты стандартному окрашиванию гематоксилином/эозином (H&E). Для количественной оценки тяжести воспаления будет использоваться метод Floren et al. оценка [41].

Оценка системного и кишечного воспаления

Системное и местное воспалительное состояние будет оцениваться на каждой экспериментальной временной шкале по скорости оседания эритроцитов (СОЭ), количеству лейкоцитов (лейкоцитов), количеству тромбоцитов в крови (ПЛТ), СРБ и фекальному лактоферрину соответственно. СОЭ будет измеряться по методу Вестергрена. СРБ будет определяться с помощью иммунонефелометрии (норма: <6 мг/л; патологическая >6 мг/л). Общий белок и альбумин оценивают биуретовым методом. Количество лейкоцитов, количество тромбоцитов и гемоглобинемия будут получены при стандартном полном подсчете клеток крови. Фекальный лактоферрин будет дозирован с помощью теста ELISA, в котором используются кроличьи поликлональные антитела, специфичные к человеческому лактоферрину, в образцах замороженного стула.

статистический анализ

Статистический анализ будет проводиться с использованием Windows Microsoft Excel и программного обеспечения Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Непрерывные данные будут выражены как медиана (диапазон); дихотомические данные будут выражены как частота и пропорция. Будут использоваться непараметрические тесты. Корреляция между штаммами бактерий и параметрами воспаления будет рассчитана с помощью теста Спирмена для оценки этио-патогенетической роли каждого штамма. Соответствующий коэффициент корреляции будет не ниже 0,50, а при двустороннем уровне статистической значимости 0,05 и мощности 0,20 размер выборки должен быть не менее 29 пациентов. Сравнение между резервуарным и здоровым резервуарным мешком будет выполняться с помощью U-критерия Манна-Уитни. Установите уровень статистической значимости 0,05 и мощность 0,20, после чего размер выборки, необходимый для сравнения, составит 16 пациентов для каждой группы. В заключение, по крайней мере, 32 пациента будут включены в это исследование. Статистическая значимость будет установлена ​​на уровне p<0,05.