Mikrobiota ja immuuni-mikroympäristö Pouchitisissa (MEP1)

Opiskelun tavoitteet

Työhypoteesi on, että suoliston mikrobiotan homeostaasin häiriö, joko spontaani tai pussin limakalvon synnynnäisen immuniteettimekanismin purkamisen aiheuttama, edistää kroonisen/relapsoivan pussitulehduksen puhkeamista. Ottaen huomioon, että pussin limakalvon bakteerikolonisaatiota voidaan ihanteellisesti tutkia sen synnystä lähtien, tätä voidaan pitää ihanteellisena mallina suoliston mikrobiotan ja synnynnäisen immuunijärjestelmän välisen vuorovaikutuksen tutkimiseen. Siksi tämän tutkimusyksikön tavoitteena on selvittää, kuinka dysbioosi ja synnynnäinen immuunijärjestelmän toimintahäiriö todetaan ja kuinka tämä toimintahäiriö edistää pussitulehduksen puhkeamista ja säilymistä. Näiden merkityksellisten patofysiologisten ongelmien ratkaisemiseksi niiden terapeuttisten vaikutusten valossa aiomme suorittaa satunnaistetun kaksoissokkotutkimuksen probiootteja vs lumelääkettä potilaille, joille tehdään kolektomia ja myöhempi sykkyräsuolen pussi-peräaukon anastomoosi. :

1. arvioida pussin limakalvoa kolonisoivan mikrobiston koostumus ja patogeeniset ominaisuudet ileostoman sulkemisen jälkeen;
2. määrittää, kuinka synnynnäisen immuunijärjestelmän ilmentyminen ja aktivaatiotila eri solutyypeissä ja pussin limakalvon anatomisissa osissa liittyvät ileostoman sulkeutumiseen;
3. seurata peräaukon pussien kliinisiä tuloksia mikrobiotan ja luontaisen immuunijärjestelmän vuorovaikutuksen valossa.

Tutkimussuunnitelma Laskimme ottavan mukaan vähintään 32 potilasta, jotka satunnaistetaan ileostoman sulkemisen yhteydessä lumelääkettä saavaan ryhmään (16 potilasta) ja ryhmään, jotka saivat lactobacillus casei GD:tä suun kautta 8 viikon ajan (16 potilasta). Limakalvonäytteet otetaan ileostoman sulkemisen ja pussin endoskopian yhteydessä 8 viikon ja 12 kuukauden iässä. Otamme kelvollisiksi ehdokkaiksi kaikki UC-potilaat, joille tehdään korjaava proktokolektomia ileaalisen pussin peräaukon anastomoosilla ja jotka käyvät poliklinikallamme rutiininomaisessa endoskooppisessa ja kliininen seuranta. Potilaat, joilla on cuffitis (peräsuolen limakalvon jäänteen tulehdus) tai pussin Crohnin tauti (jossa on perianaalisia fisteleitä tai afferentin sykkyräsuolen raajan tulehdus), sekä potilaat, jotka ovat saaneet antibiootti- tai probioottihoitoa viimeisten 30 päivän aikana. suljettu pois tutkimuksesta. Potilaita, joilla on PDAI > 7, pidetään ilmeisenä pussitulehduksena. Pöytäkirja noudattaa muutetun Helsingin julistuksen periaatteita.

Jokaiselle potilaalle annetaan yksityiskohtaista tietoa tutkimuksen tavoitteista ja menetelmistä, ja häntä pyydetään antamaan kirjallinen tietoinen suostumus ennen ilmoittautumista. Tänä aikana potilaita pyydetään ottamaan pussiendoskopia ja limakalvobiopsia sekä uloste- ja verinäytteet kolmena seuraavan kerran: a) ennen ileostoman sulkemista, b) 2 kuukautta ileostoman sulkemisen jälkeen, c) 12 kuukautta ileostoman sulkemisen jälkeen (tai ennen, ilmeinen pussitulehdus). Arvioimme taudin vakavuuden kliinisten, endoskooppisten ja histologisten kriteerien sekä PDAI:n perusteella [5]. Histologisen ja endoskooppisen akuutin tulehduksen sekä kliinisten oireiden perusteella potilaat, joiden kokonaisPDAI on > 7, luokitellaan akuuttiin pussitulehdukseen.

Pussin endoskopia suoritetaan ilman sedaatiota. Afferenttisilmukka, pussi tutkitaan huolellisesti ja biopsianäytteet otetaan: kaksi näytettä mikrobiotan karakterisointiin, kaksi tavanomaiseen histologiaan, neljä molekyylibiologiaan ja sytofluorimetriseen analyysiin. Biopsiat käsitellään ja säilytetään eri tutkimusten mukaisesti.

Mikrobiootan arviointi:

Pussiin kiinnittyneiden bakteerien karakterisoimiseksi sykkyräsuolen pussista otetut biopsiat joko pestään välittömästi varovasti löysästi kiinnittyneiden mikrobien poistamiseksi ja jäädytetään sitten nestetypessä myöhempää DNA:n uuttamista varten tai sijoitetaan tioglykolaattiväliaineeseen anaerobisten mikrobien säilyttämiseksi myöhempiä viljelmiä varten.

Bakteerifylan suhteellinen runsaus ulostenäytteissä arvioidaan sekvensoimalla 16S-rRNA-geeniin kohdistuvat PCR-amplikonit kustakin ulostenäytteestä uutetuissa DNA-näytteissä. PCR suoritetaan käyttämällä alukesarjaa (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' ja 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3'), joka kohdistuu 16S rRNA -geenien V5-V6-alueeseen [38]. Kohdealueen monistamiseksi 1 μl uutettua DNA:ta toimii templaattina 50 μl:n reaktioissa käyttäen Prime STAR HS -esiseosta (Takara Bio Inc., Japani). Kahden kunnostus-PCR-reaktion tuotteet näytettä kohti yhdistetään ja puhdistetaan käyttämällä QIAquick PCR -puhdistuspylväitä (Qiagen). Monistettuja PCR-tuotteita käytetään pyrosekvensoinnin mallina GS Junior -alustan (454 Life Sciences) kanssa. Pyrosekvensointi suoritetaan noudattamalla valmistajan ohjeita käyttämällä MID-tunnisteita. Odotamme saavamme keskimäärin noin 15 000 sekvenssiä jokaiselle näytteelle. Saaduille tiedoille suoritetaan tietoanalyysi laskennallisilla työkaluilla. Bakteerien rRNA-tyypitys suoritetaan BLASTN-haulla kattavaa rRNA-tietokantaa "silva" release 94 [39] vastaan ​​käyttämällä kynnysarvoa E-arvo <1E-40. Kaikki kustakin ulostenäytteestä saadut bakteerilajit luokitellaan fylogeneettisiin ryhmiinsä ja erilaisten bakteerien osuus arvioidaan. Operatiivisen taksonomisen yksikön (OTU) arvioinnin suorittaa ESPRIT-ohjelma oletusasetuksia käyttäen [40].

Mikrobiologisten viljelmien biopsiat, jotka on asetettu välittömästi tioglykolaattiväliaineeseen (anaerobisten mikrobien suojaamiseksi happialtistukselta), käsitellään edelleen anaerobisessa kupussa, joka on täytetty C02:H2 (95:5) -ilmakehällä. Biopsiat pestään steriilillä väriainekaasulla varustetussa suolaliuoksessa, johon on lisätty 0,016 % ditioerytritolia liman poistamiseksi, ja solujen hypotonisen hajoamisen jälkeen steriilissä vedessä kylvetään oikeille agarmaljoille pinnallisen mikroflooran arvioimiseksi. [35]. Näytteet kylvetään ei-selektiivisille (Brain Heart Infusion Agar, BHA) ja selektiivisille Enterobacteriacae spp:n (MacConkey agar) ja Lactobacillus spp (Rogosa SL agar) elatusaineille.

BHA- ja MacConkey-agarmaljoja viljellään anaerobisissa ja aerobisissa olosuhteissa (24 ja 72 tuntia, vastaavasti), kun taas Rogosa SL Agar -maljoja viljellään vain anaerobisissa olosuhteissa (72 tuntia) 37 °C:ssa. Pesäkkeet lasketaan, ryhmitellään morfologisen ulkonäön perusteella ja alistetaan morfologiselle analyysille Gram-värjäyksellä (Biolife S.r.l.). Sitten mikrobeille tehdään molekyylikarakterisointi, joka suoritetaan sekvensoimalla 16S-rRNA:n PCR-amplikonit käyttämällä "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit -reaktiosarjaa" [24]. Isolaatit karakterisoidaan edelleen niiden patogeenisyyspotentiaalin mukaan (ts. toksikogeeninen profiili ja antibioottiresistenssi).

Limakalvojen luontainen immuuniympäristö

Pussin limakalvon tulehdusverkoston analyysi sisältää

1. sytokiinien [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 ja IL-4 ja kemokiinien [MCP1] tason kvantifiointi Bio-Plex-sytokiini-immunomäärityksellä. Yksi biopsia homogenoidaan ja kirkasta supernatanttia käytetään useiden sytokiinien ja kemokiinien nykyaikaiseen kvantifiointiin räätälöidyillä määrityksillä;
2. TLR-verkoston analyysi (mRNA:n kvantifiointi ja proteiinin jakautuminen) kvantitatiivisella RT-PCR:llä ja immunohistokemialla, vastaavasti;
3. makrofagien, dendriittisolujen, tunkeutuvien lymfosyyttien aktivaatiostatuksen arviointi pintamarkkereiden (eli) ja solunsisäisten sytokiinien mallin (ts. TNF, IFN, IL4, IL10) sytofluorimetrisellä analyysillä. Kahdelle biopsialle suoritetaan hellävarainen entsymaattinen pilkkominen ja värjätään sitten asianmukaisesti leimatuilla vasta-aineilla, jotka on suunnattu pinta-antigeenejä tai solunsisäisiä sytokiinejä vastaan.

Limakalvojen antimikrobinen vaikutus. Antibakteerisen peptidiverkoston karakterisoimiseksi pussin limakalvossa, joka on vastuussa kiinnittyneen mikrobiotan muodostamisesta, a) määritämme limakalvouutteiden antimikrobiset ominaisuudet suorittamalla in vitro antibakteerisen toksisuuden määrityksen [37]; b) kvantitatiivinen epiteelistä ja leukosyyteistä peräisin olevat antimikrobiset defensiinit (kuten Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) kvantitatiivisella RT-PCR:llä.

Histologinen arviointi:

Rutiininomaista histologista tutkimusta varten kaksi biopsiaa kiinnitetään 4-prosenttiseen PFA:han 24 tunnin ajaksi, dehydratoidaan ja upotetaan parafiiniin, ja leikkeitä (5 μm paksu) leikataan ja alistetaan tavalliselle hematoksyliini/eosiini (H&E) -värjäys. Tulehduksen vakavuuden kvantifioimiseksi käytetään Floren et ai. pisteet [41].

Systeeminen ja suoliston tulehduksen arviointi

Systeeminen ja paikallinen tulehdustila arvioidaan kullakin kokeellisella aikajanalla seuraavilla tekijöillä: erytrosyyttien sedimentaationopeus (ESR), valkosolujen määrä (WBC), verihiutaleiden veriarvo (PLT), CRP ja ulosteen laktoferriini. ESR mitataan Westergren-menetelmällä. CRP havaitaan immunonefelometrialla (normaali: <6 mg/l; patologinen >6 mg/l). Kokonaisproteiini ja albumiini arvioidaan biureettimenetelmällä. Valkosolut, verihiutaleiden määrät ja hemoglobinemia mitataan normaalilla täysveren määrällä. Ulosteen laktoferriini annostellaan ELISA-testillä, jossa käytetään ihmisen laktoferriinille spesifisiä kanin polyklonaalisia vasta-aineita pakastetuista ulostenäytteistä.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttämällä Windows Microsoft Exceliä ja Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) -ohjelmistoa. Jatkuvat tiedot ilmaistaan ​​mediaanina (alue); dikotomiset tiedot ilmaistaan ​​frekvenssinä ja suhteina. Ei-parametrisia testejä käytetään. Bakteerikantojen ja tulehdusparametrien välinen korrelaatio lasketaan Spearman-testillä kunkin kannan etiopatogeneettisen roolin arvioimiseksi. Relevantti korrelaatiokerroin ei ole pienempi kuin 0,50, ja asettamalla kahden pyrstön tilastollinen merkitsevyystaso arvoon 0,05 ja teho 0,20, otoksen koon on oltava vähintään 29 potilasta. Pussitulehduksen ja terveen pussin vertailu suoritetaan Mann-Whitney U -testillä. Aseta tilastollisen merkitsevyyden tasoksi 0,05 ja potenssiksi 0,20, jolloin vertailuun vaadittava otoskoko on 16 potilasta kussakin ryhmässä. Lopuksi ainakin 32 potilasta otetaan mukaan tähän tutkimukseen. Tilastollinen merkitsevyys asetetaan arvoon p<0,05.