Mikrobiota och immunmikromiljö vid pouchitis (MEP1)

Studiemål

Arbetshypotesen är att en störning av tarmmikrobiotas homeostas, antingen spontan eller orsakad av avregleringen av det medfödda immunsystemet i påsens slemhinna, bidrar till uppkomsten av kronisk/återfallande pouchit. Med hänsyn till att bakteriell kolonisering av påsens slemhinna idealiskt kan studeras sedan dess generering, kan detta betraktas som en idealisk modell för att studera samspelet mellan tarmmikrobiota och medfödda immunsystem. Därför är målet för denna forskningsenhet att fastställa hur dysbios och medfödd dysfunktion i immunsystemet etableras och hur denna störning bidrar till uppkomsten och upprätthållandet av pouchit. För att ta itu med dessa relevanta patofysiologiska problem i ljuset av deras terapeutiska implikationer, planerar vi att utföra en randomiserad dubbelblind studie av probiotika vs placebo på patienter som kommer att genomgå kolektomi och efterföljande ileal pouch-anal anastomos för att registrera patienterna vid tidpunkten för ileostomi färg till :

1. utvärdera sammansättning och patogena egenskaper hos mikrobiotan som koloniserar påsens slemhinna efter ileostomiförslutning;
2. bestämma hur uttryck och aktiveringsstatus för det medfödda immunsystemet i olika celltyper och anatomiska områden i påsslemhinnan relaterar till ileostomiförslutning;
3. följa upp det kliniska resultatet av analpåsar i ljuset av mikrobiota-medfödda immunsystems samspel.

Studiedesign Under en tvåårsperiod beräknade vi att rekrytera minst 32 patienter som kommer att randomiseras vid stängning av ileostomi i en grupp som får placebo (16 patienter) och i en grupp som får lactobacillus casei GD oralt tillskott under 8 veckor (16 patienter). Slemhinneprover kommer att skördas vid stängning av ileostomi och vid påsendoskopi vid 8 veckor och 12 månader. Vi kommer att överväga kvalificerade kandidater för alla patienter med UC som kommer att genomgå reparativ proctocolectomy med ileal pouch anal anastomosis och som kommer att gå på vår poliklinik och rutinmässiga endoskopiska kliniker klinisk uppföljning. Patienter med cuffit (inflammation i ändtarmsslemhinnan) eller Crohns sjukdom i påsen (med perianala fistlar eller med inflammation i den afferenta ileala delen), samt patienter som kommer att ha fått antibiotika- eller probiotisk behandling under de senaste 30 dagarna utesluten från studien. Patienter med PDAI>7 kommer att betraktas som öppen pouchit. Protokollet kommer att följa principerna i den ändrade Helsingforsdeklarationen.

Varje patient kommer att förses med detaljerad information om studiens mål och metod och kommer att uppmanas att ge skriftligt, informerat samtycke före registreringen. Under denna period kommer patienter att uppmanas att genomgå påsendoskopi med slemhinnebiopsier, avföring och blodprov vid tre följande tidpunkter: a) före ileostomiförslutning, b) 2 månader efter ileostomiförslutning, c) 12 månader efter ileostomiförslutning (eller före, i fall av öppen pouchit). Baserat på kliniska, endoskopiska och histologiska kriterier och PDAI kommer vi att bedöma sjukdomens svårighetsgrad [5]. Baserat på histologisk och endoskopisk akut inflammation samt kliniska symtom kommer patienter med en total PDAI >7 att klassificeras som akut pouchit.

Endoskopi av påsen kommer att utföras utan sedering. Den afferenta slingan, påsen kommer att undersökas noggrant och biopsiprovtagning kommer att utföras: två prover för mikrobiotakarakterisering, två för konventionell histologi, fyra för molekylärbiologi och cytofluorimetrisk analys. Biopsier kommer att hanteras och lagras i enlighet med de olika studierna.

Mikrobiotabedömning:

För att karakterisera bakterier som fäster vid påsens slemhinna kommer biopsier från ilealpåsen antingen omedelbart tvättas försiktigt för att avlägsna löst vidhäftande mikrober och sedan frysas i flytande kväve för efterföljande DNA-extraktion, eller placeras i tioglykolatmedium för att bevara anaeroba mikrober för efterföljande kulturer.

Relativ förekomst av bakteriefyla i fekala prover kommer att uppskattas genom att sekvensera PCR-amplikonerna som riktar sig till 16S rRNA-genen för DNA-proverna som extraherats från varje fekalt prov. PCR kommer att utföras med primeruppsättningen (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ och 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′) som riktar sig mot V5-V6-regionen av 16S rRNA-generna [38]. För att amplifiera målregionen kommer 1 μl extraherat DNA att fungera som mall i 50 μl reaktioner med Prime STAR HS premix (Takara Bio Inc., Japan). Produkter från de två rekonditionerande PCR-reaktionerna per prov kommer att kombineras och renas med hjälp av QIAquick PCR-reningskolonner (Qiagen). De amplifierade PCR-produkterna kommer att användas som mall för pyrosekvensering med GS Junior-plattformen (454 Life Sciences). Pyrosequencing kommer att utföras genom att följa tillverkarens instruktioner med hjälp av MID-taggar. Vi räknar med att få cirka 15 000 sekvenser för varje prov i genomsnitt. Den erhållna datan kommer att utsättas för en dataanalys utförd av beräkningsverktyg. Bakteriell rRNA-typning kommer att utföras genom BLASTN-sökning mot den omfattande rRNA-databasen "silva" release 94 [39] med ett tröskelvärde på E-värde <1E-40. Alla bakteriearter som erhålls från varje fekalt prov kommer att klassificeras i sina fylogenetiska grupper och andelen olika phyla kommer att uppskattas. Uppskattningen av operationell taxonomic unit (OTU) kommer att utföras av programmet ESPRIT med standardinställningar [40].

För mikrobiologiska kulturer kommer biopsier som omedelbart placeras i tioglykolatmedium (för att skydda anaeroba mikrober från syreexponering) att manipuleras ytterligare i en anaerob huva fylld med C02:H2 (95:5) atmosfär. Biopsier kommer att tvättas i steril färggasad koksaltlösning kompletterad med 0,016 % ditioerytritol för att ta bort slemmet och efter cellhypotonisk lysis i sterilt vatten, ympas i lämpliga agarplattor för att utvärdera den ytliga mikrofloran. [35]. Prover kommer att sås på icke-selektiva (Brain Heart Infusion Agar, BHA) och selektiva medier för Enterobacteriacae spp (MacConkey-agar) och Lactobacillus spp (Rogosa SL-agar).

BHA- och MacConkey-agarplattor kommer att odlas under anaeroba och aeroba förhållanden (24 respektive 72 timmar), medan Rogosa SL-agarplattor endast kommer att odlas under anaeroba förhållanden (72 timmar) vid 37 °C. Kolonier kommer att räknas, grupperas på basis av morfologiskt utseende och underkastas morfologisk analys genom Gram-färgning (Biolife S.r.l.). Därefter kommer mikrober att utsättas för molekylär karakterisering, utförd genom sekvensering av PCR-amplikoner av 16S rRNA med användning av ett "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Isolat kommer att karakteriseras ytterligare enligt deras patogenicitetspotential (dvs. toxigen profil och antibiotikaresistens).

Mukosal medfödd immunmiljö

Analys av det inflammatoriska nätverket i påsens slemhinna kommer att omfatta

1. kvantifiering av cytokiner [IL-1 ß, IL-6, TNF- , TGF ß, IL-10 och IL-4 och kemokiner [MCP1,] nivå genom Bio-Plex cytokin immunoassay. En biopsi kommer att homogeniseras och den klara supernatanten används för den samtida kvantifieringen av flera cytokiner och kemokiner genom specialdesignade analyser;
2. analys av TLR-nätverk (mRNA-kvantifiering och proteindistribution) genom kvantitativ RT-PCR respektive immunhistokemi;
3. bedömning av aktiveringsstatus för makrofager, dendritiska celler, infiltrerande lymfocyter som utvärderar ytmarkörer (dvs.) och intracellulära cytokinmönster (dvs. TNF, IFN, IL4, IL10) genom cytofluorimetrisk analys. Två biopsier kommer att utsättas för skonsam enzymatisk nedbrytning och sedan färgas med korrekt märkta antikroppar riktade mot ytantigener eller intracellulära cytokiner.

Mukosal antimikrobiell aktivitet. För att karakterisera det antibakteriella peptidnätverket i påsens slemhinna som ansvarar för att forma den vidhäftande mikrobiotan kommer vi att a) bestämma de antimikrobiella egenskaperna hos slemhinneextrakt genom att utföra en antibakteriell toxicitetsanalys in vitro [37]; b) kvantifiera epitel- och leukocythärledda antimikrobiella defensiner (såsom Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) genom kvantitativ RT-PCR.

Histologisk utvärdering:

För rutinmässig histologisk undersökning fixeras två biopsier i 4 % PFA under 24 timmar, dehydreras sedan och bäddas in i paraffin, och sektioner (5 μm tjocka) skärs ut och utsätts för standardfärgning av hematoxylin/eosin (H&E). För att kvantifiera inflammatorisk svårighetsgrad kommer Floren et al. poäng [41].

Systemisk och tarminflammationsbedömning

Systemiskt och lokalt inflammatoriskt tillstånd kommer att bedömas vid varje experimentell tidslinje genom: erytrocytsedimentationshastighet (ESR), antal vita blodkroppar (WBC), antal blodplättar (PLT), CRP respektive fekalt laktoferrin. ESR kommer att mätas med Westergren-metoden. CRP kommer att detekteras med immunnefelometri (normalt: <6 mg/l; patologiskt >6 mg/l). Totalt protein och albumin kommer att bedömas med biuretmetoden. WBC, trombocytantal och hemoglobinemi kommer att erhållas med standard fullt antal blodkroppar. Fekalt laktoferrin kommer att doseras genom ett ELISA-test som använder polyklonala kaninantikroppar specifika för humant laktoferrin på frusna avföringsprover.

Statistisk analys

Statistisk analys kommer att utföras med Windows Microsoft Excel och en programvara Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Kontinuerliga data kommer att uttryckas som median (intervall); dikotomidata kommer att uttryckas som frekvens och proportion. Icke-parametriska tester kommer att användas. Korrelation mellan bakteriestammar och inflammatoriska parametrar kommer att beräknas med Spearman-testet för att utvärdera den etiopatogenetiska rollen för varje stam. Relevant korrelationskoefficient kommer inte att vara sämre än 0,50 och om man ställer in en statistisk signifikansnivå med två svansar på 0,05 och styrkan på 0,20, måste den påföljande urvalsstorleken vara minst 29 patienter. Jämförelse mellan pouchitis och frisk påse kommer att utföras med Mann-Whitney U-test. Ställ in en nivå av statistisk signifikans till 0,05 och en effekt på 0,20, den följdstorlek som krävs för jämförelse kommer att vara 16 patienter för varje grupp. Sammanfattningsvis kommer minst 32 patienter att inkluderas i denna studie. Statistisk signifikans kommer att sättas till p<0,05.