Microbiota e microambiente imunológico na bolsite (MEP1)

Objetivos do estudo

A hipótese de trabalho é que uma interrupção da homeostase da microbiota intestinal, seja espontânea ou causada pela desregulação da maquinaria da imunidade inata dentro da mucosa da bolsa, contribui para o aparecimento de bolsite crônica/recorrente. Tendo em conta que a colonização bacteriana da mucosa da bolsa pode ser idealmente estudada desde a sua geração, este pode ser considerado um modelo ideal para estudar a interação entre a microbiota intestinal e o sistema imunológico inato. Assim, o objetivo desta Unidade de Investigação é estabelecer como se estabelece a disbiose e a disfunção da maquinaria da imunidade inata e como esta disfunção contribui para o aparecimento e manutenção da bolsite. Para abordar essas questões fisiopatológicas relevantes à luz de suas implicações terapêuticas, planejamos realizar um estudo duplo-cego randomizado de probióticos versus placebo em pacientes que serão submetidos a colectomia e subsequente bolsa ileal-anastomose anal para inscrever os pacientes no momento da ileostomia colure para :

1. avaliar a composição e as propriedades patogênicas da microbiota que coloniza a mucosa da bolsa após o fechamento da ileostomia;
2. determinar como a expressão e o status de ativação do sistema de imunidade inata em diferentes tipos de células e distritos anatômicos da mucosa da bolsa se relacionam com o fechamento da ileostomia;
3. acompanhar o resultado clínico de bolsas anais à luz da interação microbiota-sistema imunológico inato.

Desenho do estudo Em um período de dois anos, calculamos incluir pelo menos 32 pacientes que serão randomizados no fechamento da ileostomia em um grupo recebendo placebo (16 pacientes) e em um grupo recebendo suplementação oral de lactobacillus casei GD por 8 semanas (16 pacientes). Amostras de mucosa serão colhidas no fechamento da ileostomia e na endoscopia da bolsa às 8 semanas e aos 12 meses. Consideraremos candidatos elegíveis todos os pacientes com CU que serão submetidos a proctocolectomia restauradora com anastomose anal da bolsa ileal e que comparecerão ao nosso ambulatório para exames endoscópicos e acompanhamento clínico. Pacientes com cuffitis (inflamação do remanescente da mucosa retal) ou doença de Crohn da bolsa (com fístula perianal ou com inflamação do ramo ileal aferente), bem como pacientes que receberam terapia antibiótica ou probiótica durante os 30 dias anteriores serão excluídos do estudo. Pacientes com PDAI>7 serão considerados como bolsite evidente. O protocolo cumprirá os princípios da Declaração de Helsinque emendada.

Cada paciente receberá informações detalhadas sobre os objetivos e a metodologia do estudo e será solicitado a dar consentimento informado por escrito antes da inscrição. Durante este período, os pacientes serão submetidos a endoscopia de bolsa com biópsias de mucosa, amostras fecais e de sangue em três momentos seguintes: a) antes do fechamento da ileostomia, b) 2 meses após o fechamento da ileostomia, c) 12 meses após o fechamento da ileostomia (ou antes, em caso de bolsite evidente). Com base em critérios clínicos, endoscópicos, histológicos e IPD avaliaremos a gravidade da doença [5]. Com base na inflamação aguda histológica e endoscópica, bem como nos sintomas clínicos, os pacientes com um PDAI total > 7 serão classificados como portadores de bolsite aguda.

A endoscopia da bolsa será realizada sem sedação. A alça aferente, a bolsa serão cuidadosamente examinadas e serão realizadas biópsias: duas amostras para caracterização da microbiota, duas para histologia convencional, quatro para biologia molecular e análise citofluorimétrica. As biópsias serão manuseadas e armazenadas de acordo com os diferentes estudos.

Avaliação da microbiota:

Para caracterizar as bactérias aderentes à mucosa da bolsa, as biópsias da bolsa ileal serão imediatamente lavadas suavemente para remover micróbios frouxamente aderentes e depois congeladas em nitrogênio líquido para extração subsequente de DNA ou colocadas em meio de tioglicolato para preservar micróbios anaeróbicos para culturas subsequentes.

A abundância relativa de filos bacterianos em espécimes fecais será estimada pelo sequenciamento dos amplicons de PCR direcionados ao gene 16S rRNA para as amostras de DNA extraídas de cada espécime fecal. A PCR será realizada usando o conjunto de primers (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' e 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3') que tem como alvo a região V5-V6 dos genes 16S rRNA [38]. Para amplificar a região alvo, 1 μl de DNA extraído servirá como modelo em reações de 50 μl usando a pré-mistura Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Japão). Os produtos das duas reações de PCR de recondicionamento por amostra serão combinados e purificados usando colunas de purificação de PCR QIAquick (Qiagen). Os produtos de PCR amplificados serão usados ​​como modelo para pirosequenciamento com a plataforma GS Junior (454 Life Sciences). A pirosequenciação será realizada seguindo as instruções do fabricante usando tags MID. Esperamos obter cerca de 15.000 sequências para cada amostra, em média. Os dados obtidos serão submetidos a uma análise de dados realizada por ferramentas computacionais. A tipagem de rRNA bacteriano será realizada por pesquisa BLASTN contra o abrangente banco de dados de rRNA "silva" versão 94 [39] usando um limite de valor E <1E-40. Todas as espécies bacterianas obtidas de cada amostra fecal serão classificadas em seus grupos filogenéticos e a proporção dos diferentes filos será estimada. A estimativa da unidade taxonômica operacional (OTU) será realizada pelo programa ESPRIT usando configurações padrão [40].

Para culturas microbiológicas, as biópsias imediatamente colocadas em meio tioglicolato (para proteger micróbios anaeróbicos da exposição ao oxigênio) serão posteriormente manipuladas em uma capela anaeróbica preenchida com atmosfera de C02:H2 (95:5). As biópsias serão lavadas em solução salina gaseificada estéril suplementada com ditioeritritol 0,016% para remoção do muco e após lise celular hipotônica em água estéril, semeadas em placas de ágar próprias para avaliação da microflora superficial. [35]. As amostras serão semeadas em meio não seletivo (Brain Heart Infusion Agar, BHA) e meio seletivo para Enterobacteriacae spp (ágar MacConkey) e Lactobacillus spp (ágar Rogosa SL).

As placas de ágar BHA e MacConkey serão cultivadas em condições anaeróbias e aeróbicas (24 e 72 horas, respectivamente), enquanto as placas de ágar Rogosa SL serão cultivadas apenas em condições anaeróbicas (72 horas) a 37°C. As colônias serão contadas, agrupadas com base no aspecto morfológico e submetidas à análise morfológica por coloração de Gram (Biolife S.r.l.). Em seguida, os micróbios serão submetidos à caracterização molecular, realizada por sequenciamento de amplicons de PCR de 16S rRNA utilizando um "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Os isolados serão posteriormente caracterizados de acordo com seu potencial de patogenicidade (i.e. perfil toxigênico e resistência a antibióticos).

Ambiente imune inato da mucosa

A análise da rede inflamatória na mucosa da bolsa incluirá

1. quantificação do nível de citocinas [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF-ß, IL-10 e IL-4 e quimiocinas [MCP1,] por imunoensaio de citocinas Bio-Plex. Uma biópsia será homogeneizada e o sobrenadante transparente usado para a quantificação contemporânea de múltiplas citocinas e quimiocinas por ensaios personalizados;
2. análise da rede de TLRs (quantificação de mRNA e distribuição de proteínas) por RT-PCR quantitativo e imuno-histoquímica, respectivamente;
3. avaliação do estado de ativação de macrófagos, células dendríticas, infiltração de linfócitos avaliando marcadores de superfície (ou seja) e padrão de citocinas intracelulares (ou seja, TNF, IFN, IL4, IL10) por análise citofluorimétrica. Duas biópsias serão submetidas a digestão enzimática suave e, em seguida, coradas com anticorpos devidamente marcados dirigidos contra antígenos de superfície ou citocinas intracelulares.

Atividade antimicrobiana da mucosa. Para caracterizar a rede de peptídeos antibacterianos na mucosa da bolsa responsável por moldar a microbiota aderente, iremos a) determinar as propriedades antimicrobianas dos extratos da mucosa realizando ensaios de toxicidade antibacteriana in vitro [37]; b) quantificar defensinas antimicrobianas epiteliais e derivadas de leucócitos (como Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) por RT-PCR quantitativo.

Avaliação histológica:

Para exame histológico de rotina, duas biópsias serão fixadas em PFA 4% por 24 horas, depois desidratadas e embebidas em parafina, e seções (5 μm de espessura) serão cortadas e submetidas à coloração padrão de hematoxilina/eosina (H&E). Para quantificar a gravidade inflamatória será utilizado o teste de Floren et al. pontuação [41].

Avaliação da inflamação sistêmica e intestinal

O estado inflamatório sistêmico e local será avaliado em cada linha do tempo experimental por: velocidade de hemossedimentação (VHS), contagem de leucócitos (WBC), contagem de plaquetas (PLT), PCR e lactoferrina fecal, respectivamente. A ESR será medida pelo método Westergren. A PCR será detectada por imunonefelometria (normal: <6 mg/l; patológica >6mg/l). Proteína total e albumina serão avaliadas pelo método do biureto. WBC, contagem de plaquetas e hemoglobinemia serão obtidos com contagem de células sanguíneas completa padrão. A lactoferrina fecal será dosada por um teste ELISA que usa anticorpos policlonais de coelho específicos para lactoferrina humana em amostras de fezes congeladas.

Análise estatística

A análise estatística será realizada usando o Windows Microsoft Excel e um software Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Dados contínuos serão expressos como mediana (intervalo); os dados dicotômicos serão expressos em frequência e proporção. Serão utilizados testes não paramétricos. A correlação entre cepas de bactérias e parâmetros inflamatórios será calculada com o teste de Spearman para avaliar o papel etiopatogenético de cada cepa. O coeficiente de correlação relevante não será inferior a 0,50 e, estabelecendo um nível de significância estatística bicaudal em 0,05 e poder em 0,20, o consequente tamanho amostral deverá ser de no mínimo 29 pacientes. A comparação entre bolsite e bolsa saudável será realizada com o teste U de Mann-Whitney. Defina um nível de significância estatística em 0,05 e um poder em 0,20, o tamanho da amostra necessária para comparação será de 16 pacientes para cada grupo. Em conclusão, pelo menos 32 pacientes serão incluídos neste estudo. A significância estatística será estabelecida em p<0,05.