Microbiota en immuun micro-omgeving bij Pouchitis (MEP1)

Studiedoelen

De werkhypothese is dat een verstoring van de homeostase van de darmmicrobiota, hetzij spontaan, hetzij veroorzaakt door de deregulering van de aangeboren immuniteitsmachinerie in de buidelmucosa, bijdraagt ​​aan het ontstaan ​​van chronische/relapsing pouchitis. Rekening houdend met het feit dat bacteriële kolonisatie van het buidelslijmvlies ideaal kan worden bestudeerd sinds de generatie ervan, kan dit worden beschouwd als een ideaal model om de wisselwerking tussen darmmicrobiota en aangeboren immuunsysteem te bestuderen. Daarom is het doel van deze onderzoekseenheid om vast te stellen hoe dysbiose en disfunctie van aangeboren immuniteitsmechanismen tot stand komen en hoe deze disfunctie bijdraagt ​​aan het ontstaan ​​en in stand houden van pouchitis. Om deze relevante pathofysiologische problemen aan te pakken in het licht van hun therapeutische implicaties, zijn we van plan een gerandomiseerde dubbelblinde studie probiotica versus placebo uit te voeren bij patiënten die een colectomie en daaropvolgende ileumzakje-anale anastomose zullen ondergaan om de patiënten in te schrijven op het moment van ileostoma colure om :

1. evalueer de samenstelling en pathogene eigenschappen van de microbiota die het slijmvlies van de buidel koloniseert na sluiting van het ileostoma;
2. bepalen hoe expressie en activeringsstatus van het aangeboren immuniteitssysteem in verschillende celtypen en anatomische districten van het slijmvlies van de buidel zich verhouden tot ileostomasluiting;
3. follow-up van de klinische uitkomst van anale zakjes in het licht van de wisselwerking tussen microbiota en aangeboren immuunsysteem.

Onderzoeksopzet Over een periode van twee jaar hebben we berekend dat ten minste 32 patiënten die gerandomiseerd zullen worden bij het sluiten van het ileostoma, worden opgenomen in een groep die placebo krijgt (16 patiënten) en in een groep die lactobacillus casei GD orale suppletie krijgt gedurende 8 weken (16 patiënten). Slijmvliesmonsters worden geoogst bij sluiting van het ileostoma en bij endoscopie van het ileostoma na 8 weken en na 12 maanden. We overwegen in aanmerking komende kandidaten voor alle patiënten met UC die een herstellende proctocolectomie zullen ondergaan met anale anastomose van het ileumzakje en die onze polikliniek zullen bezoeken voor routinematige endoscopische en klinische opvolging. Patiënten met cuffitis (ontsteking van het rectale slijmvliesrestant) of de ziekte van Crohn van de pouch (met perianale fistels of met ontsteking van het afferente ileale ledemaat), evenals patiënten die gedurende de voorgaande 30 dagen antibiotica of probiotische therapie hebben gekregen, zullen uitgesloten van de studie. Patiënten met PDAI>7 worden beschouwd als openlijke pouchitis. Het protocol zal voldoen aan de beginselen van de gewijzigde Verklaring van Helsinki.

Elke patiënt zal worden voorzien van gedetailleerde informatie over de onderzoeksdoelen en methodologie en zal worden gevraagd om schriftelijke, geïnformeerde toestemming te geven voorafgaand aan de inschrijving. Gedurende deze periode zullen patiënten worden gevraagd een pouch-endoscopie te ondergaan met mucosale biopsieën, feces- en bloedmonsters op de volgende drie tijdstippen: a) vóór sluiting van het ileostoma, b) 2 maanden na sluiting van het ileostoma, c) 12 maanden na sluiting van het ileostoma (of vóór, in geval van openlijke pouchitis). Op basis van klinische, endoscopische en histologische criteria en PDAI zullen we de ernst van de ziekte beoordelen [5]. Op basis van zowel histologische en endoscopische acute ontsteking als klinische symptomen, worden patiënten met een totale PDAI >7 geclassificeerd als acute pouchitis.

Endoscopie van het zakje zal worden uitgevoerd zonder sedatie. De afferente lus, het zakje zal zorgvuldig worden onderzocht en er zullen biopsiemonsters worden genomen: twee monsters voor karakterisering van de microbiota, twee voor conventionele histologie, vier voor moleculaire biologie en cytofluorimetrische analyse. Biopsieën zullen worden behandeld en opgeslagen in overeenstemming met de verschillende onderzoeken.

Beoordeling microbiota:

Om de aan de buidel gehechte bacteriën te karakteriseren, worden biopsieën uit de ileale buidel ofwel onmiddellijk voorzichtig gewassen om losjes hechtende microben te verwijderen en vervolgens ingevroren in vloeibare stikstof voor daaropvolgende DNA-extractie, of in thioglycolaatmedium geplaatst om anaerobe microben te behouden voor volgende kweken.

De relatieve hoeveelheid bacteriële phyla in fecale monsters zal worden geschat door de PCR-amplicons die gericht zijn op het 16S rRNA-gen te sequentiëren voor de DNA-monsters die uit elk fecaal monster zijn geëxtraheerd. PCR zal worden uitgevoerd met behulp van de primerset (784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' en 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3') die zich richt op het V5-V6-gebied van de 16S rRNA-genen [38]. Om het beoogde gebied te amplificeren, zal 1 μl geëxtraheerd DNA dienen als sjabloon in reacties van 50 μl met behulp van Prime STAR HS-premix (Takara Bio Inc., Japan). Producten van de twee reconditionerings-PCR-reacties per monster zullen worden gecombineerd en gezuiverd met behulp van QIAquick PCR-zuiveringskolommen (Qiagen). De geamplificeerde PCR-producten zullen worden gebruikt als een sjabloon voor pyrosequencing met het GS Junior-platform (454 Life Sciences). Pyrosequencing wordt uitgevoerd door de instructies van de fabrikant te volgen met behulp van MID-tags. We verwachten gemiddeld ongeveer 15.000 sequenties voor elk monster te verkrijgen. De verkregen gegevens zullen worden onderworpen aan een data-analyse uitgevoerd door computationele tools. Bacteriële rRNA-typering zal worden uitgevoerd door BLASTN-zoekopdracht tegen de uitgebreide rRNA-database "silva" release 94 [39] met een drempelwaarde van E-waarde <1E-40. Alle bacteriesoorten die uit elk fecaal monster worden verkregen, worden ingedeeld in hun fylogenetische groepen en het aandeel van de verschillende phyla wordt geschat. De schatting van de operationele taxonomische eenheid (OTU) zal worden uitgevoerd door het programma ESPRIT met standaardinstellingen [40].

Voor microbiologische culturen worden biopsieën die onmiddellijk in thioglycolaatmedium worden geplaatst (om anaerobe microben te beschermen tegen blootstelling aan zuurstof) verder gemanipuleerd in een anaerobe kap gevuld met C02:H2 (95:5) atmosfeer. Biopsieën zullen worden gewassen in een steriele, met kleurstof vergaste zoutoplossing aangevuld met 0,016% dithioerythritol om het slijm te verwijderen en na celhypotonische lysis in steriel water, geënt in geschikte agarplaten om de oppervlakkige microflora te evalueren. [35]. Monsters zullen worden geënt op niet-selectieve (Brain Heart Infusion Agar, BHA) en selectieve media voor Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) en Lactobacillus spp (Rogosa SL agar).

BHA- en MacConkey-agarplaten worden gekweekt in anaerobe en aerobe omstandigheden (respectievelijk 24 en 72 uur), terwijl Rogosa SL-agarplaten alleen worden gekweekt in anaerobe omstandigheden (72 uur) bij 37°C. Kolonies zullen worden geteld, gegroepeerd op basis van morfologisch uiterlijk en onderworpen aan morfologische analyse door middel van Gram-kleuring (Biolife S.r.l.). Vervolgens zullen microben worden onderworpen aan moleculaire karakterisering, uitgevoerd door sequentiebepaling van PCR-amplicons van 16S rRNA met behulp van een "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Isolaten zullen verder worden gekarakteriseerd volgens hun pathogeniteitspotentieel (d.w.z. toxicogeen profiel en antibioticaresistentie).

Mucosale aangeboren immuunomgeving

Analyse van het ontstekingsnetwerk in de buidelmucosa zal omvatten

1. kwantificering van cytokines [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGFß, IL-10 en IL-4 en chemokines [MCP1,] niveau door Bio-Plex cytokine immunoassay. Eén biopsie zal worden gehomogeniseerd en het heldere supernatant zal worden gebruikt voor de hedendaagse kwantificering van meerdere cytokines en chemokines door op maat ontworpen assays;
2. analyse van het TLR-netwerk (mRNA-kwantificering en eiwitdistributie) door respectievelijk kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie;
3. beoordeling van de activeringsstatus van macrofagen, dendritische cellen, infiltrerende lymfocyten evaluatie van oppervlaktemarkers (d.w.z.) en intracellulair cytokinepatroon (d.w.z. TNF, IFN, IL4, IL10) door cytofluorimetrische analyse. Twee biopsieën zullen worden onderworpen aan zachte enzymatische digestie en vervolgens worden gekleurd met correct gelabelde antilichamen gericht tegen oppervlakte-antigenen of intracellulaire cytokines.

Mucosale antimicrobiële activiteit. Om het antibacteriële peptidenetwerk in de buidelmucosa te karakteriseren dat verantwoordelijk is voor het vormgeven van de hechtende microbiota, zullen we a) de antimicrobiële eigenschappen van slijmvliesextracten bepalen door een in vitro antibacteriële toxiciteitstest uit te voeren [37]; b) kwantificeren van epitheel en van leukocyten afgeleide antimicrobiële defensinen (zoals Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) door kwantitatieve RT-PCR.

Histologische evaluatie:

Voor routinematig histologisch onderzoek worden twee biopsieën gefixeerd in 4% PFA gedurende 24 uur, vervolgens gedehydrateerd en ingebed in paraffine, en secties (5 μm dik) worden gesneden en onderworpen aan standaard hematoxyline/eosine (H&E)-kleuring. Om de ernst van de ontsteking te kwantificeren, zullen de Floren et al. scoren [41].

Systemische en intestinale ontstekingsbeoordeling

Systemische en lokale inflammatoire toestand zal op elke experimentele tijdlijn worden beoordeeld aan de hand van respectievelijk: erytrocytsedimentatiesnelheid (ESR), aantal witte bloedcellen (WBC), aantal bloedplaatjes (PLT), CRP en fecaal lactoferrine. ESR wordt gemeten volgens de Westergren-methode. CRP wordt gedetecteerd door middel van immuno-nefelometrie (normaal: <6 mg/l; pathologisch >6mg/l). Totaal eiwit en albumine worden beoordeeld met de biureetmethode. WBC, aantal bloedplaatjes en hemoglobinemie worden verkregen met standaard volledig aantal bloedcellen. Fecale lactoferrine zal worden gedoseerd door een ELISA-test die polyklonale konijnenantilichamen gebruikt die specifiek zijn voor humaan lactoferrine op bevroren ontlastingsmonsters.

statistische analyse

Statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van Windows Microsoft Excel en Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) software. Continue gegevens worden uitgedrukt als mediaan (bereik); dichotome gegevens worden uitgedrukt als frequentie en proportie. Er zullen niet-parametrische tests worden gebruikt. De correlatie tussen bacteriestammen en ontstekingsparameters zal worden berekend met de Spearman-test om de etiopathogenetische rol van elke stam te evalueren. De relevante correlatiecoëfficiënt zal niet lager zijn dan 0,50 en door een tweezijdig statistisch significantieniveau in te stellen op 0,05 en power op 0,20, zal de resulterende steekproefomvang ten minste 29 patiënten moeten zijn. Vergelijking tussen pouchitis en gezonde pouch wordt uitgevoerd met de Mann-Whitney U-test. Stel een niveau van statistische significantie in op 0,05 en een vermogen op 0,20, de resulterende steekproefomvang die nodig is voor vergelijking is 16 patiënten voor elke groep. Concluderend zullen ten minste 32 patiënten in deze studie worden opgenomen. De statistische significantie wordt vastgesteld op p<0,05.