Microbiote et microenvironnement immunitaire dans la pochite (MEP1)

Objectifs de l'étude

L'hypothèse de travail est qu'une perturbation de l'homéostasie du microbiote intestinal, qu'elle soit spontanée ou causée par la dérégulation de la machinerie immunitaire innée au sein de la muqueuse de la poche, contribue à l'apparition de la pochite chronique/récurrente. Tenant compte du fait que la colonisation bactérienne de la muqueuse de la poche peut être idéalement étudiée depuis sa génération, cela peut être considéré comme un modèle idéal pour étudier l'interaction entre le microbiote intestinal et le système immunitaire inné. Par conséquent, l'objectif de cette unité de recherche est d'établir comment s'établissent la dysbiose et le dysfonctionnement de la machinerie immunitaire innée et comment ce dysfonctionnement contribue à l'apparition et au maintien de la pochite. Pour résoudre ces problèmes physiopathologiques pertinents à la lumière de leurs implications thérapeutiques, nous prévoyons de réaliser une étude randomisée en double aveugle probiotiques vs placebo chez des patients qui subiront une colectomie et une anastomose iléo-anale ultérieure pour recruter les patients au moment de la colure iléostomie pour :

1. évaluer la composition et les propriétés pathogènes du microbiote qui colonise la muqueuse de la poche après la fermeture de l'iléostomie ;
2. déterminer comment l'expression et l'état d'activation du système immunitaire inné dans différents types de cellules et districts anatomiques de la muqueuse de la poche sont liés à la fermeture de l'iléostomie ;
3. suivre l'évolution clinique des poches anales à la lumière de l'interaction microbiote-système immunitaire inné.

Conception de l'étude Sur une période de deux ans, nous avons calculé qu'il fallait recruter au moins 32 patients qui seront randomisés à la fermeture de l'iléostomie dans un groupe recevant un placebo (16 patients) et dans un groupe recevant une supplémentation orale en lactobacillus casei GD pendant 8 semaines (16 patients). Des échantillons de muqueuse seront prélevés à la fermeture de l'iléostomie et à l'endoscopie de la poche à 8 semaines et à 12 mois. suivi clinique. Les patients atteints de cuffite (inflammation du vestige de la muqueuse rectale) ou de la maladie de Crohn de la poche (avec fistules périanales ou avec inflammation de la branche iléale afférente), ainsi que les patients qui auront reçu un traitement antibiotique ou probiotique au cours des 30 jours précédents seront exclus de l'étude. Les patients avec PDAI> 7 seront considérés comme une pochite manifeste. Le protocole respectera les principes de la déclaration d'Helsinki modifiée.

Chaque patient recevra des informations détaillées sur les objectifs et la méthodologie de l'étude et sera invité à donner son consentement écrit et éclairé avant son inscription. Au cours de cette période, les patients seront invités à subir une endoscopie de poche avec des biopsies muqueuses, des prélèvements fécaux et sanguins aux trois moments suivants : a) avant la fermeture de l'iléostomie, b) 2 mois après la fermeture de l'iléostomie, c) 12 mois après la fermeture de l'iléostomie (ou avant, en cas de pochite manifeste). Sur la base de critères cliniques, endoscopiques et histologiques et du PDAI, nous évaluerons la gravité de la maladie [5]. Sur la base de l'inflammation aiguë histologique et endoscopique ainsi que des symptômes cliniques, les patients avec un PDAI total> 7 seront classés comme ayant une pochite aiguë.

L'endoscopie de la poche sera réalisée sans sédation. L'anse afférente, la poche seront minutieusement examinées et des prélèvements biopsiques seront réalisés : deux prélèvements pour la caractérisation du microbiote, deux pour l'histologie conventionnelle, quatre pour la biologie moléculaire et l'analyse cytofluorimétrique. Les biopsies seront manipulées et conservées en fonction des différentes études.

Évaluation du microbiote :

Pour caractériser les bactéries adhérentes à la poche, les biopsies muqueuses de la poche iléale seront soit immédiatement lavées doucement pour éliminer les microbes faiblement adhérents, puis congelées dans de l'azote liquide pour une extraction ultérieure de l'ADN, soit placées dans un milieu au thioglycolate pour préserver les microbes anaérobies pour les cultures ultérieures.

L'abondance relative des phylums bactériens dans les échantillons fécaux sera estimée en séquençant les amplicons PCR ciblant le gène ARNr 16S pour les échantillons d'ADN extraits de chaque échantillon fécal. La PCR sera réalisée à l'aide du jeu d'amorces (784F : 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ et 1061R : 5′-CRRCACGAGCTGACCGAC-3′) qui cible la région V5-V6 des gènes d'ARNr 16S [38]. Pour amplifier la région ciblée, 1 μl d'ADN extrait servira de matrice dans des réactions de 50 μl en utilisant le prémélange Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Japon). Les produits des deux réactions PCR de reconditionnement par échantillon seront combinés et purifiés à l'aide de colonnes de purification QIAquick PCR (Qiagen). Les produits de PCR amplifiés serviront de matrice pour le pyroséquençage avec la plateforme GS Junior (454 Life Sciences). Le pyroséquençage sera effectué en suivant les instructions du fabricant à l'aide d'étiquettes MID. Nous prévoyons d'obtenir environ 15 000 séquences pour chaque échantillon, en moyenne. Les données obtenues seront soumises à une analyse de données effectuée par des outils informatiques. Le typage de l'ARNr bactérien sera effectué par recherche BLASTN par rapport à la base de données complète d'ARNr "silva" version 94 [39] en utilisant un seuil de valeur E <1E-40. Toutes les espèces bactériennes obtenues à partir de chaque échantillon fécal seront classées dans leurs groupes phylogénétiques et la proportion de différents phylums sera estimée. L'estimation de l'unité taxonomique opérationnelle (OTU) sera effectuée par le programme ESPRIT en utilisant les paramètres par défaut [40].

Pour les cultures microbiologiques, les biopsies immédiatement placées dans un milieu au thioglycolate (pour protéger les microbes anaérobies de l'exposition à l'oxygène) seront ensuite manipulées dans une hotte anaérobie remplie d'une atmosphère de C02:H2 (95:5). Les biopsies seront lavées dans une solution saline gazeuse stérile additionnée de 0,016 % de dithioérythritol pour éliminer le mucus et après la lyse hypotonique des cellules dans de l'eau stérile, ensemencées dans des plaques de gélose appropriées pour évaluer la microflore superficielle. [35]. Les échantillons seront ensemencés sur des milieux non sélectifs (Brain Heart Infusion Agar, BHA) et sélectifs pour Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) et Lactobacillus spp (Rogosa SL agar).

Les plaques de gélose BHA et MacConkey seront cultivées dans des conditions anaérobies et aérobies (24 et 72 heures, respectivement), tandis que les plaques Rogosa SL Agar ne seront cultivées que dans des conditions anaérobies (72 heures) à 37°C. Les colonies seront comptées, regroupées sur la base de l'aspect morphologique et soumises à une analyse morphologique par coloration de Gram (Biolife S.r.l.). Ensuite, les microbes seront soumis à une caractérisation moléculaire, réalisée par séquençage d'amplicons PCR d'ARNr 16S à l'aide d'un "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Les isolats seront davantage caractérisés en fonction de leur potentiel de pathogénicité (c.-à-d. profil toxicogène et résistance aux antibiotiques).

Environnement immunitaire inné muqueux

L'analyse du réseau inflammatoire dans la muqueuse de la poche comprendra

1. dosage des cytokines [IL-1ß, IL-6, TNF- , TGF ß, IL-10 et IL-4 et des chimiokines [MCP1,] par dosage immunologique des cytokines Bio-Plex. Une biopsie sera homogénéisée et le surnageant clair utilisé pour la quantification contemporaine de plusieurs cytokines et chimiokines par des tests conçus sur mesure ;
2. analyse du réseau des TLR (quantification des ARNm et distribution des protéines) par RT-PCR quantitative et immunohistochimie, respectivement ;
3. évaluation de l'état d'activation des macrophages, des cellules dendritiques, des lymphocytes infiltrants évaluation des marqueurs de surface (c.-à-d.) et du profil des cytokines intracellulaires (c.-à-d. TNF, IFN, IL4, IL10) par analyse cytofluorimétrique. Deux biopsies seront soumises à une digestion enzymatique douce puis colorées avec des anticorps correctement marqués dirigés contre des antigènes de surface ou des cytokines intracellulaires.

Activité antimicrobienne muqueuse. Pour caractériser le réseau peptidique antibactérien dans la muqueuse de la poche responsable de la formation du microbiote adhérent, nous allons a) déterminer les propriétés antimicrobiennes des extraits muqueux en effectuant un test de toxicité antibactérienne in vitro [37] ; b) quantifier les défensines antimicrobiennes dérivées de l'épithélium et des leucocytes (telles que Def2, Def3 ; DEFA5 ; DEFA6) par RT-PCR quantitative.

Évaluation histologique :

Pour l'examen histologique de routine, deux biopsies seront fixées dans du PFA à 4 % pendant 24 heures, puis déshydratées et incluses dans de la paraffine, et des coupes (5 μm d'épaisseur) seront coupées et soumises à une coloration standard à l'hématoxyline/éosine (H&E). Pour quantifier la sévérité inflammatoire on utilisera le Floren et al. note [41].

Évaluation de l'inflammation systémique et intestinale

L'état inflammatoire systémique et local sera évalué à chaque chronologie expérimentale par : la vitesse de sédimentation des érythrocytes (ESR), la numération des globules blancs (WBC), la numération plaquettaire (PLT), la CRP et la lactoferrine fécale, respectivement. L'ESR sera mesurée par la méthode de Westergren. La CRP sera détectée par immuno-néphélométrie (normal : <6 mg/l ; pathologique >6mg/l). Les protéines totales et l'albumine seront évaluées avec la méthode du biuret. Les globules blancs, la numération plaquettaire et l'hémoglobinémie seront obtenus avec une numération globulaire complète standard. La lactoferrine fécale sera dosée par un test ELISA qui utilise des anticorps polyclonaux de lapin spécifiques de la lactoferrine humaine sur des échantillons de selles congelées.

analyses statistiques

L'analyse statistique sera effectuée à l'aide de Windows Microsoft Excel et d'un logiciel Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Les données continues seront exprimées sous forme de médiane (gamme); les données dichotomiques seront exprimées en fréquence et en proportion. Des tests non paramétriques seront utilisés. La corrélation entre les souches bactériennes et les paramètres inflammatoires sera calculée avec le test de Spearman pour évaluer le rôle étio-pathogénétique de chaque souche. Le coefficient de corrélation pertinent ne sera pas inférieur à 0,50 et, en fixant un niveau de signification statistique bilatéral à 0,05 et une puissance à 0,20, la taille de l'échantillon conséquent devra être d'au moins 29 patients. La comparaison entre la pochite et la poche saine sera effectuée avec le test U de Mann-Whitney. Fixez un niveau de signification statistique à 0,05 et une puissance à 0,20, la taille d'échantillon conséquente requise pour la comparaison sera de 16 patients pour chaque groupe. En conclusion, au moins 32 patients seront inclus dans cette étude. La signification statistique sera fixée à p<0,05.