Microbiota y microambiente inmunitario en la reservoritis (MEP1)

Objetivos del estudio

La hipótesis de trabajo es que una interrupción de la homeostasis de la microbiota intestinal, ya sea espontánea o causada por la desregulación de la maquinaria de inmunidad innata dentro de la mucosa de la bolsa, contribuye a la aparición de reservoritis crónica/recurrente. Teniendo en cuenta que la colonización bacteriana de la mucosa de la bolsa se puede estudiar idealmente desde su generación, esto se puede considerar como un modelo ideal para estudiar la interacción entre la microbiota intestinal y el sistema inmunológico innato. Por tanto, el objetivo de esta Unidad de Investigación es establecer cómo se establece la disbiosis y la disfunción de la maquinaria de la inmunidad innata y cómo esta disfunción contribuye a la aparición y mantenimiento de la reservoritis. Para abordar estos problemas fisiopatológicos relevantes a la luz de sus implicaciones terapéuticas, planeamos realizar un estudio aleatorizado doble ciego con probióticos versus placebo en pacientes que se someterán a colectomía y posterior anastomosis ileoanal con bolsa para inscribir a los pacientes en el momento de la ileostomía colure para :

1. evaluar la composición y las propiedades patogénicas de la microbiota que coloniza la mucosa del reservorio después del cierre de la ileostomía;
2. determinar cómo la expresión y el estado de activación del sistema de inmunidad innato en diferentes tipos de células y distritos anatómicos de la mucosa de la bolsa se relacionan con el cierre de la ileostomía;
3. seguimiento del resultado clínico de las bolsas anales a la luz de la interacción entre la microbiota y el sistema inmunitario innato.

Diseño del estudio En un período de dos años, calculamos inscribir al menos a 32 pacientes que serán aleatorizados en el cierre de la ileostomía en un grupo que recibió placebo (16 pacientes) y en un grupo que recibió suplementos orales de lactobacillus casei GD durante 8 semanas (16 pacientes). Las muestras de mucosa se recolectarán en el cierre de la ileostomía y en la endoscopia con reservorio a las 8 semanas y a los 12 meses. Consideraremos candidatos elegibles a todos los pacientes con CU que se someterán a proctocolectomía restauradora con anastomosis ileoanal con reservorio y que asistirán a nuestra clínica ambulatoria para endoscopia y seguimiento clínico. Los pacientes con cuffitis (inflamación del remanente de la mucosa rectal) o enfermedad de Crohn del reservorio (con fístulas perianales o con inflamación del asa ileal aferente), así como los pacientes que hayan recibido terapia antibiótica o probiótica durante los 30 días previos serán excluidos del estudio. Los pacientes con PDAI>7 se considerarán reservoritis manifiesta. El protocolo cumplirá con los principios de la Declaración de Helsinki enmendada.

Cada paciente recibirá información detallada sobre los objetivos y la metodología del estudio y se le pedirá que dé su consentimiento informado por escrito antes de la inscripción. Durante este período, se pedirá a los pacientes que se sometan a una endoscopia de bolsa con biopsias de la mucosa, muestras de heces y sangre en los tres momentos siguientes: a) antes del cierre de la ileostomía, b) 2 meses después del cierre de la ileostomía, c) 12 meses después del cierre de la ileostomía (o antes, en caso de reservoritis manifiesta). Basándonos en criterios clínicos, endoscópicos, histológicos y PDAI evaluaremos la gravedad de la enfermedad [5]. Según la inflamación aguda histológica y endoscópica, así como los síntomas clínicos, los pacientes con un PDAI total >7 se clasificarán como reservoritis aguda.

La endoscopia de la bolsa se realizará sin sedación. Se examinará cuidadosamente el asa aferente, el reservorio y se tomarán biopsias: dos muestras para caracterización de microbiota, dos para histología convencional, cuatro para biología molecular y análisis citofluorimétrico. Las biopsias se manipularán y almacenarán de acuerdo con los diferentes estudios.

Evaluación de la microbiota:

Para caracterizar las bacterias adheridas a la mucosa de la bolsa, las biopsias de la bolsa ileal se lavarán inmediatamente con cuidado para eliminar los microbios poco adherentes y luego se congelarán en nitrógeno líquido para la posterior extracción de ADN, o se colocarán en medio de tioglicolato para preservar los microbios anaerobios para cultivos posteriores.

La abundancia relativa de filos bacterianos en muestras fecales se estimará mediante la secuenciación de los amplicones de PCR dirigidos al gen 16S rRNA para las muestras de ADN extraídas de cada muestra fecal. La PCR se realizará utilizando el conjunto de cebadores (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ y 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′) que se dirige a la región V5-V6 de los genes 16S rRNA [38]. Para amplificar la región objetivo, 1 μl de ADN extraído servirá como plantilla en reacciones de 50 μl utilizando la premezcla Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Japón). Los productos de las dos reacciones de PCR de reacondicionamiento por muestra se combinarán y purificarán utilizando columnas de purificación QIAquick PCR (Qiagen). Los productos de PCR amplificados se utilizarán como plantilla para la pirosecuenciación con la plataforma GS Junior (454 Life Sciences). La pirosecuenciación se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando etiquetas MID. Esperamos obtener unas 15.000 secuencias para cada muestra, en promedio. Los datos obtenidos serán sometidos a un análisis de datos realizado por herramientas computacionales. La tipificación de ARNr bacteriano se realizará mediante la búsqueda BLASTN en la versión 94 [39] de la base de datos de ARNr integral "silva" utilizando un umbral de valor E <1E-40. Todas las especies bacterianas obtenidas de cada muestra fecal se clasificarán en sus grupos filogenéticos y se estimará la proporción de diferentes filos. La estimación de la unidad taxonómica operativa (OTU) será realizada por el programa ESPRIT utilizando la configuración predeterminada [40].

Para cultivos microbiológicos, las biopsias colocadas inmediatamente en medio de tioglicolato (para proteger a los microbios anaerobios de la exposición al oxígeno) se manipularán más en una campana anaerobia llena de atmósfera de C02:H2 (95:5). Las biopsias se lavarán en solución salina esterilizada con gas colorante suplementada con ditioeritritol al 0,016 % para eliminar la mucosidad y, tras la lisis celular hipotónica en agua estéril, se sembrarán en placas de agar adecuadas para evaluar la microflora superficial. [35]. Las muestras se sembrarán en medios no selectivos (Brain Heart Infusion Agar, BHA) y medios selectivos para Enterobacteriacae spp (agar MacConkey) y Lactobacillus spp (agar Rogosa SL).

Las placas de agar BHA y MacConkey se cultivarán en condiciones anaeróbicas y aeróbicas (24 y 72 horas, respectivamente), mientras que las placas de agar Rogosa SL solo se cultivarán en condiciones anaeróbicas (72 horas) a 37 °C. Las colonias se contarán, se agruparán en función de su aspecto morfológico y se someterán a análisis morfológico mediante tinción de Gram (Biolife S.r.l.). Luego, los microbios se someterán a la caracterización molecular, realizada mediante la secuenciación de amplicones de PCR de 16S rRNA utilizando un "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]. Los aislamientos se caracterizarán además de acuerdo con su potencial de patogenicidad (es decir, perfil toxigénico y resistencia a los antibióticos).

Entorno inmune innato de la mucosa

El análisis de la red inflamatoria en la mucosa de la bolsa incluirá

1. cuantificación de citocinas [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 e IL-4 y nivel de quimiocinas [MCP1,] mediante inmunoensayo de citocinas Bio-Plex. Se homogeneizará una biopsia y se usará el sobrenadante claro para la cuantificación contemporánea de múltiples citocinas y quimiocinas mediante ensayos diseñados a medida;
2. análisis de red de TLRs (cuantificación de ARNm y distribución de proteínas) por RT-PCR cuantitativa e inmunohistoquímica, respectivamente;
3. evaluación del estado de activación de macrófagos, células dendríticas, linfocitos infiltrantes evaluación de marcadores de superficie (es decir) y patrón de citocinas intracelulares (es decir, TNF, IFN, IL4, IL10) por análisis citofluorimétrico. Se someterán dos biopsias a una digestión enzimática suave y luego se teñirán con anticuerpos debidamente marcados dirigidos contra antígenos de superficie o citoquinas intracelulares.

Actividad antimicrobiana mucosa. Para caracterizar la red de péptidos antibacterianos en la mucosa de la bolsa responsable de dar forma a la microbiota adherente, a) determinaremos las propiedades antimicrobianas de los extractos de la mucosa mediante la realización de un ensayo de toxicidad antibacteriana in vitro [37]; b) cuantificar las defensinas antimicrobianas epiteliales y derivadas de leucocitos (tales como Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) mediante RT-PCR cuantitativa.

Evaluación histológica:

Para el examen histológico de rutina, se fijarán dos biopsias en PFA al 4 % durante 24 horas, luego se deshidratarán y se incluirán en parafina, y se cortarán secciones (5 μm de espesor) y se someterán a tinción estándar con hematoxilina/eosina (H&E). Para cuantificar la severidad inflamatoria se utilizará la de Floren et al. puntuación [41].

Evaluación de la inflamación sistémica e intestinal

El estado inflamatorio sistémico y local se evaluará en cada línea de tiempo experimental mediante: tasa de sedimentación de eritrocitos (ESR), recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de plaquetas en sangre (PLT), PCR y lactoferrina fecal, respectivamente. La VSG se medirá por el método de Westergren. La PCR se detectará por inmunonefelometría (normal: <6 mg/l; patológica >6 mg/l). La proteína total y la albúmina se evaluarán con el método de biuret. Los recuentos de WBC, plaquetas y hemoglobinemia se obtendrán con un hemograma completo estándar. La lactoferrina fecal se dosificará mediante una prueba ELISA que utiliza anticuerpos policlonales de conejo específicos para la lactoferrina humana en muestras de heces congeladas.

análisis estadístico

El análisis estadístico se realizará utilizando Windows Microsoft Excel y un software Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Los datos continuos se expresarán como mediana (rango); los datos dicotómicos se expresarán como frecuencia y proporción. Se utilizarán pruebas no paramétricas. La correlación entre las cepas de bacterias y los parámetros inflamatorios se calculará con la prueba de Spearman para evaluar el papel etiopatogenético de cada cepa. El coeficiente de correlación relevante no será inferior a 0,50 y, fijando un nivel de significación estadística de dos colas en 0,05 y una potencia de 0,20, el tamaño de la muestra resultante deberá ser de al menos 29 pacientes. La comparación entre reservorio tisular y reservorio sano se realizará con la prueba U de Mann-Whitney. Establezca un nivel de significación estadística en 0,05 y una potencia en 0,20, por lo que el tamaño de muestra requerido para la comparación será de 16 pacientes para cada grupo. En conclusión, al menos 32 pacientes participarán en este estudio. La significación estadística se establecerá en p<0,05.