Mikrobiota a imunitní mikroprostředí u pouchitidy (MEP1)

Studijní cíle

Pracovní hypotéza je, že narušení homeostázy střevní mikroflóry, ať už spontánní nebo způsobené deregulací mechanismu přirozené imunity ve sliznici váčku, přispívá k nástupu chronické/recidivující pouchitidy. Vezmeme-li v úvahu, že bakteriální kolonizaci sliznice váčku lze ideálně studovat od jeho vytvoření, lze to považovat za ideální model pro studium souhry mezi střevní mikrobiotou a vrozeným imunitním systémem. Cílem této výzkumné jednotky je proto zjistit, jak vzniká dysbióza a dysfunkce mechanismů přirozené imunity a jak tato dysfunkce přispívá ke vzniku a udržování pouchitidy. Abychom se vypořádali s těmito relevantními patofyziologickými problémy ve světle jejich terapeutických důsledků, plánujeme provést randomizovanou dvojitě zaslepenou studii probiotik vs :

1. vyhodnotit složení a patogenní vlastnosti mikroflóry, která kolonizuje sliznici váčku po uzavření ileostomie;
2. určit, jak souvisí exprese a stav aktivace vrozeného imunitního systému v různých typech buněk a anatomických oblastech sliznice váčku s uzavřením ileostomie;
3. sledování klinického výsledku análních váčků ve světle souhry vrozeného imunitního systému mikrobioty.

Uspořádání studie Za období dvou let jsme vypočítali zařazení alespoň 32 pacientů, kteří budou randomizováni při uzavření ileostomie do skupiny dostávající placebo (16 pacientů) a do skupiny dostávající lactobacillus casei GD perorální suplementaci po dobu 8 týdnů (16 pacientů). Vzorky sliznice budou odebrány při uzávěru ileostomie a při pouch endoskopii v 8 týdnech a ve 12 měsících. Jako vhodné kandidáty budeme zvažovat všechny pacienty s UC, kteří podstoupí restorativní proktokolektomii s anastomózou ileálního pouchu a kteří budou navštěvovat naši ambulanci pro rutinní endoskopické a klinické sledování. Pacienti s cuffitidou (zánět zbytků rektální sliznice) nebo Crohnovou chorobou váčku (s perianální píštělí nebo se zánětem aferentní ileální končetiny), jakož i pacienti, kteří v předchozích 30 dnech dostávali antibiotickou nebo probiotickou léčbu. vyloučen ze studia. Pacienti s PDAI>7 budou považováni za zjevnou pouchitidu. Protokol bude v souladu se zásadami pozměněné Helsinské deklarace.

Každý pacient dostane podrobné informace o cílech a metodologii studie a bude požádán, aby před zařazením dal písemný informovaný souhlas. Během tohoto období budou pacienti požádáni, aby podstoupili vakovou endoskopii s biopsií sliznice, odběrem vzorků stolice a krve ve třech následujících časech: a) před uzavřením ileostomie, b) 2 měsíce po uzavření ileostomie, c) 12 měsíců po uzavření ileostomie (nebo před, v případ zjevné pouchitidy). Na základě klinických, endoskopických a histologických kritérií a PDAI posoudíme závažnost onemocnění [5]. Na základě histologického a endoskopického akutního zánětu a také klinických příznaků budou pacienti s celkovým PDAI >7 klasifikováni jako pacienti s akutní pouchitidou.

Endoskopie vaku bude provedena bez sedace. Aferentní smyčka, vak budou pečlivě vyšetřeny a provede se odběr biopsie: dva vzorky pro charakterizaci mikrobioty, dva pro konvenční histologii, čtyři pro molekulární biologii a cytofluorimetrickou analýzu. Biopsie budou zpracovány a uchovávány v souladu s různými studiemi.

Hodnocení mikroflóry:

Pro charakterizaci bakterií adherujících na sliznici váčku se biopsie z ileálního váčku buď okamžitě jemně promyjí, aby se odstranily volně ulpívající mikroby, a poté se zmrazí v tekutém dusíku pro následnou extrakci DNA, nebo se umístí do thioglykolátového média, aby se uchovaly anaerobní mikroby pro následné kultury.

Relativní množství bakteriálních kmenů ve vzorcích stolice bude odhadnuto sekvenováním amplikonů PCR zacílených na gen 16S rRNA pro vzorky DNA extrahované z každého vzorku stolice. PCR bude provedena pomocí sady primerů (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ a 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′), která cílí na oblast V5-V6 genů 16S rRNA [38]. K amplifikaci cílové oblasti bude 1 μl extrahované DNA sloužit jako templát v 50 μl reakcích s použitím premixu Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Japonsko). Produkty dvou rekondicionačních PCR reakcí na vzorek budou spojeny a purifikovány pomocí purifikačních kolon QIAquick PCR (Qiagen). Amplifikované produkty PCR budou použity jako templát pro pyrosekvenování s platformou GS Junior (454 Life Sciences). Pyrosekvenování bude provedeno podle pokynů výrobce pomocí MID tagů. Očekáváme, že pro každý vzorek získáme v průměru asi 15 000 sekvencí. Získaná data budou podrobena datové analýze provedené výpočetními nástroji. Bakteriální typizace rRNA bude provedena vyhledáváním BLASTN proti komplexní databázi rRNA "silva" release 94 [39] s použitím prahu E-hodnoty <1E-40. Všechny bakteriální druhy získané z každého vzorku stolice budou zařazeny do jejich fylogenetických skupin a bude odhadnut podíl různých kmenů. Odhad provozní taxonomické jednotky (OTU) provede program ESPRIT s výchozím nastavením [40].

Pro mikrobiologické kultury budou biopsie okamžitě umístěné do thioglykolátového média (k ochraně anaerobních mikrobů před expozicí kyslíku) dále zpracovávány v anaerobním krytu naplněném atmosférou C02:H2 (95:5). Biopsie budou promyty sterilním fyziologickým roztokem s plynným barvivem doplněným 0,016% dithioerythritolem k odstranění hlenu a po hypotonické lýze buněk ve sterilní vodě, naočkovány na správné agarové plotny pro hodnocení povrchové mikroflóry. [35]. Vzorky budou naočkovány na neselektivní (Brain Heart Infusion Agar, BHA) a selektivní média pro Enterobacteriacae spp (MacConkey agar) a Lactobacillus spp (Rogosa SL agar).

Agarové misky BHA a MacConkey budou kultivovány v anaerobních a aerobních podmínkách (24 a 72 hodin), zatímco misky s agarem Rogosa SL budou kultivovány pouze v anaerobních podmínkách (72 hodin) při 37 °C. Kolonie budou spočítány, seskupeny na základě morfologického vzhledu a podrobeny morfologické analýze Gramovým barvením (Biolife S.r.l.). Poté budou mikrobi podrobeni molekulární charakterizaci, provedené sekvenováním PCR amplikonů 16S rRNA pomocí „Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit“ [24]. Izoláty budou dále charakterizovány podle jejich potenciálu patogenity (tj. toxikogenní profil a antibiotická rezistence).

Slizniční přirozené imunitní prostředí

Analýza zánětlivé sítě ve sliznici váčku bude zahrnovat

1. kvantifikace hladiny cytokinů [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF ß, IL-10 a IL-4 a chemokinů [MCP1,] cytokinovým imunotestem Bio-Plex. Jedna biopsie bude homogenizována a čirý supernatant bude použit pro současnou kvantifikaci více cytokinů a chemokinů pomocí zakázkově navržených testů;
2. analýza sítě TLR (kvantifikace mRNA a distribuce proteinů) pomocí kvantitativní RT-PCR a imunohistochemie, v daném pořadí;
3. hodnocení stavu aktivace makrofágů, dendritických buněk, infiltrujících lymfocytů hodnocení povrchových markerů (tj.) a vzoru intracelulárních cytokinů (tj. TNF, IFN, IL4, IL10) cytofluorimetrickou analýzou. Dvě biopsie budou podrobeny jemnému enzymatickému štěpení a poté obarveny vhodně značenými protilátkami namířenými proti povrchovým antigenům nebo intracelulárním cytokinům.

Slizniční antimikrobiální aktivita. Abychom charakterizovali antibakteriální peptidovou síť ve sliznici váčku zodpovědnou za tvarování adherentní mikroflóry, a) určíme antimikrobiální vlastnosti slizničních extraktů provedením testu antibakteriální toxicity in vitro [37]; b) kvantifikovat antimikrobiální defensiny odvozené z epitelu a leukocytů (jako je Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) pomocí kvantitativní RT-PCR.

Histologické hodnocení:

Pro rutinní histologické vyšetření budou dvě biopsie fixovány ve 4% PFA po dobu 24 hodin, poté dehydratovány a zality v parafínu a řezy (5 μm silné) budou nařezány a podrobeny standardnímu barvení hematoxylin/eozin (H&E). Pro kvantifikaci závažnosti zánětu bude použit Floren et al. skóre [41].

Hodnocení systémového a střevního zánětu

Systémový a lokální zánětlivý stav bude hodnocen v každé experimentální časové ose podle: rychlosti sedimentace erytrocytů (ESR), počtu bílých krvinek (WBC), krevního obrazu krevních destiček (PLT), CRP a fekálního laktoferinu, v daném pořadí. ESR bude měřeno Westergrenovou metodou. CRP bude detekováno imunonefelometrií (normální: <6 mg/l; patologické >6 mg/l). Celková bílkovina a albumin budou hodnoceny biuretovou metodou. Počet bílých krvinek, počet krevních destiček a hemoglobinémie budou získány standardním úplným počtem krvinek. Fekální laktoferin bude dávkován testem ELISA, který využívá králičí polyklonální protilátky specifické pro lidský laktoferin na vzorcích zmrazené stolice.

Statistická analýza

Statistická analýza bude provedena pomocí Windows Microsoft Excel a softwaru Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Spojitá data budou vyjádřena jako medián (rozsah); dichotomické údaje budou vyjádřeny jako četnost a podíl. Budou použity neparametrické testy. Korelace mezi bakteriálními kmeny a zánětlivými parametry bude vypočítána pomocí Spearmanova testu k vyhodnocení etiopatogenetické role každého kmene. Relevantní korelační koeficient nebude nižší než 0,50 a při nastavení hladiny dvoustranné statistické významnosti na 0,05 a síly na 0,20 bude následná velikost vzorku muset být alespoň 29 pacientů. Porovnání mezi pouchitidou a zdravým pouchem bude provedeno Mann-Whitney U testem. Nastavte hladinu statistické významnosti na 0,05 a sílu na 0,20, následná velikost vzorku požadovaná pro srovnání bude 16 pacientů pro každou skupinu. Na závěr bude do této studie zařazeno alespoň 32 pacientů. Statistická významnost bude nastavena na p<0,05.