Mikrobiota und immunologische Mikroumgebung bei Pouchitis (MEP1)

Studienziele

Die Arbeitshypothese ist, dass eine Störung der Homöostase der Darmmikrobiota, entweder spontan oder verursacht durch die Deregulierung der angeborenen Immunmaschinerie innerhalb der Pouchschleimhaut, zum Ausbruch einer chronischen/rezidivierenden Pouchitis beiträgt. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die bakterielle Besiedlung der Pouchschleimhaut seit ihrer Entstehung ideal untersucht werden kann, kann dies als ideales Modell angesehen werden, um das Zusammenspiel zwischen Darmmikrobiota und angeborenem Immunsystem zu untersuchen. Daher ist es das Ziel dieser Forschergruppe herauszufinden, wie Dysbiose und angeborene Immunfunktionsstörungen entstehen und wie diese Funktionsstörungen zum Ausbruch und Fortbestehen einer Pouchitis beitragen. Um diese relevanten pathophysiologischen Probleme im Hinblick auf ihre therapeutischen Implikationen anzugehen, planen wir die Durchführung einer randomisierten Doppelblindstudie Probiotika vs. Placebo bei Patienten, die sich einer Kolektomie und einer anschließenden Anastomose des Ileumbeutels unterziehen, um die Patienten zum Zeitpunkt der Ileostomie-Kolure einzuschreiben :

1. Bewertung der Zusammensetzung und pathogenen Eigenschaften der Mikrobiota, die die Beutelschleimhaut nach dem Verschluss des Ileostomas besiedeln;
2. zu bestimmen, wie der Expressions- und Aktivierungsstatus des angeborenen Immunsystems in verschiedenen Zelltypen und anatomischen Bezirken der Beutelschleimhaut mit dem Verschluss des Ileostomas zusammenhängt;
3. Follow-up des klinischen Ergebnisses von Analbeuteln im Lichte des Zusammenspiels von Mikrobiota und angeborenem Immunsystem.

Studiendesign Wir berechneten, dass in einem Zeitraum von zwei Jahren mindestens 32 Patienten aufgenommen werden, die beim Verschluss des Ileostomas randomisiert in eine Gruppe aufgenommen werden, die Placebo (16 Patienten) erhält, und in eine Gruppe, die 8 Wochen lang eine orale Supplementierung mit Lactobacillus casei GD erhält (16 Patienten). Schleimhautproben werden beim Verschluss des Ileostomas und bei der Pouch-Endoskopie nach 8 Wochen und 12 Monaten entnommen. Als geeignete Kandidaten betrachten wir alle Patienten mit CU, die sich einer restaurativen Proktokolektomie mit analer Anastomose des Ileumbeutels unterziehen und die unsere Ambulanz für routinemäßige endoskopische und endoskopische Untersuchungen aufsuchen klinische Nachsorge. Patienten mit Manschetteitis (Entzündung der Rektumschleimhautreste) oder Morbus Crohn des Beutels (mit perianalen Fisteln oder mit Entzündung des zuführenden Ileums) sowie Patienten, die in den letzten 30 Tagen eine antibiotische oder probiotische Therapie erhalten haben vom Studium ausgeschlossen. Patienten mit PDAI>7 werden als manifeste Pouchitis betrachtet. Das Protokoll wird den Grundsätzen der geänderten Deklaration von Helsinki entsprechen.

Jeder Patient erhält detaillierte Informationen über die Studienziele und -methodik und wird gebeten, vor der Aufnahme eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung zu erteilen. Während dieses Zeitraums werden die Patienten gebeten, sich zu drei folgenden Zeitpunkten einer Pouch-Endoskopie mit Schleimhautbiopsien, Kot- und Blutentnahme zu unterziehen: a) vor dem Verschluss des Ileostomas, b) 2 Monate nach dem Verschluss des Ileostomas, c) 12 Monate nach dem Verschluss des Ileostomas (oder vor, in bei manifester Pouchitis). Basierend auf klinischen, endoskopischen und histologischen Kriterien und PDAI werden wir den Schweregrad der Erkrankung beurteilen [5]. Basierend auf der histologischen und endoskopischen akuten Entzündung sowie den klinischen Symptomen werden Patienten mit einem Gesamt-PDAI > 7 als akute Pouchitis klassifiziert.

Die Endoskopie des Beutels wird ohne Sedierung durchgeführt. Die afferente Schleife, der Pouch werden sorgfältig untersucht und es werden Biopsieproben entnommen: zwei Proben für die Charakterisierung der Mikrobiota, zwei für die konventionelle Histologie, vier für die Molekularbiologie und die zytofluorimetrische Analyse. Biopsien werden entsprechend den verschiedenen Studien behandelt und gelagert.

Bewertung der Mikrobiota:

Um Bakterien zu charakterisieren, die an der Beutelschleimhaut anhaften, werden Biopsien aus dem Ileumbeutel entweder sofort vorsichtig gewaschen, um lose anhaftende Mikroben zu entfernen, und dann für die anschließende DNA-Extraktion in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Thioglykolatmedium gegeben, um anaerobe Mikroben für nachfolgende Kulturen zu konservieren.

Die relative Häufigkeit von Bakterienstämmen in Kotproben wird durch Sequenzierung der PCR-Amplikons abgeschätzt, die auf das 16S-rRNA-Gen für die aus jeder Kotprobe extrahierten DNA-Proben abzielen. Die PCR wird unter Verwendung des Primersets (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ und 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′) durchgeführt, das auf die V5-V6-Region der 16S-rRNA-Gene abzielt [38]. Um die Zielregion zu amplifizieren, dient 1 μl der extrahierten DNA als Matrize in 50-μl-Reaktionen unter Verwendung von Prime STAR HS-Premix (Takara Bio Inc., Japan). Die Produkte der beiden Rekonditionierungs-PCR-Reaktionen pro Probe werden kombiniert und mit QIAquick PCR-Reinigungssäulen (Qiagen) gereinigt. Die amplifizierten PCR-Produkte werden als Vorlage für die Pyrosequenzierung mit der GS Junior-Plattform (454 Life Sciences) verwendet. Die Pyrosequenzierung wird gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von MID-Tags durchgeführt. Wir erwarten, im Durchschnitt etwa 15.000 Sequenzen für jede Probe zu erhalten. Die erhaltenen Daten werden einer Datenanalyse unterzogen, die von Computerwerkzeugen durchgeführt wird. Bakterielle rRNA-Typisierung wird durch BLASTN-Suche gegen die umfassende rRNA-Datenbank „silva“ Release 94 [39] unter Verwendung eines Schwellenwerts von E-Wert <1E-40 durchgeführt. Alle aus jeder Kotprobe gewonnenen Bakterienarten werden in ihre phylogenetischen Gruppen eingeteilt und der Anteil der verschiedenen Phyla abgeschätzt. Die Schätzung der operationellen taxonomischen Einheit (OTU) wird vom Programm ESPRIT unter Verwendung von Standardeinstellungen durchgeführt [40].

Für mikrobiologische Kulturen werden Biopsien, die sofort in Thioglykolat-Medium gelegt werden (um anaerobe Mikroben vor Sauerstoffexposition zu schützen), in einer mit CO2:H2 (95:5)-Atmosphäre gefüllten anaeroben Haube weiter manipuliert. Die Biopsien werden in steriler farbstoffbegaster Kochsalzlösung gewaschen, die mit 0,016 % Dithioerythritol ergänzt ist, um den Schleim zu entfernen, und nach einer hypotonischen Zelllyse in sterilem Wasser in geeigneten Agarplatten ausgesät, um die oberflächliche Mikroflora zu bewerten. [35]. Die Proben werden auf nicht-selektiven (Brain Heart Infusion Agar, BHA) und selektiven Medien für Enterobacteriacae spp (MacConkey-Agar) und Lactobacillus spp (Rogosa SL-Agar) ausgesät.

BHA- und MacConkey-Agarplatten werden unter anaeroben und aeroben Bedingungen (24 bzw. 72 Stunden) kultiviert, während Rogosa SL-Agarplatten nur unter anaeroben Bedingungen (72 Stunden) bei 37 °C kultiviert werden. Die Kolonien werden gezählt, auf der Grundlage des morphologischen Aussehens gruppiert und einer morphologischen Analyse durch Gram-Färbung (Biolife S.r.l.) unterzogen. Anschließend werden Mikroben einer molekularen Charakterisierung unterzogen, die durch Sequenzierung von PCR-Amplikons von 16S-rRNA unter Verwendung eines „Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit“ [24] durchgeführt wird. Isolate werden weiter nach ihrem Pathogenitätspotential charakterisiert (d.h. toxigenes Profil und Antibiotikaresistenz).

Mukosa angeborene Immunumgebung

Die Analyse des entzündlichen Netzwerks in der Beutelschleimhaut umfasst

1. Quantifizierung von Zytokinen [IL-1ß, IL-6, TNF-, TGF-ß, IL-10 und IL-4 und Chemokinen [MCP1] durch Bio-Plex-Zytokin-Immunoassay. Eine Biopsie wird homogenisiert und der klare Überstand für die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Zytokine und Chemokine durch kundenspezifische Assays verwendet;
2. Analyse des TLR-Netzwerks (mRNA-Quantifizierung und Proteinverteilung) durch quantitative RT-PCR bzw. Immunhistochemie;
3. Bewertung des Aktivierungsstatus von Makrophagen, dendritischen Zellen, infiltrierenden Lymphozyten, Bewertung von Oberflächenmarkern (d. h.) und intrazellulären Zytokinmustern (d. h. TNF, IFN, IL4, IL10) durch zytofluorimetrische Analyse bestimmt. Zwei Biopsien werden einem sanften enzymatischen Verdau unterzogen und dann mit richtig markierten Antikörpern gefärbt, die gegen Oberflächenantigene oder intrazelluläre Zytokine gerichtet sind.

Antimikrobielle Aktivität der Schleimhaut. Zur Charakterisierung des antibakteriellen Peptidnetzwerks in der Beutelschleimhaut, das für die Formung der anhaftenden Mikrobiota verantwortlich ist, werden wir a) die antimikrobiellen Eigenschaften von Schleimhautextrakten bestimmen, indem wir einen antibakteriellen In-vitro-Toxizitätstest durchführen [37]; b) aus Epithel und Leukozyten stammende antimikrobielle Defensine (wie Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) durch quantitative RT-PCR quantifizieren.

Histologische Auswertung:

Für die routinemäßige histologische Untersuchung werden zwei Biopsien 24 Stunden lang in 4 % PFA fixiert, dann dehydriert und in Paraffin eingebettet, und Schnitte (5 μm dick) werden geschnitten und einer Standard-Hämatoxylin/Eosin (H&E)-Färbung unterzogen. Zur Quantifizierung des Schweregrades der Entzündung wird die Methode von Floren et al. Partitur [41].

Systemische und intestinale Entzündungsbewertung

Der systemische und lokale Entzündungszustand wird zu jedem experimentellen Zeitpunkt bewertet durch: Erythrozytensedimentationsrate (ESR), Leukozytenzahl (WBC), Blutplättchenzahl (PLT), CRP bzw. fäkales Lactoferrin. ESR wird nach der Westergren-Methode gemessen. CRP wird immunnephelometrisch nachgewiesen (normal: <6 mg/l; pathologisch >6mg/l). Gesamtprotein und Albumin werden mit der Biuret-Methode bestimmt. WBC, Thrombozytenzahl und Hämoglobinämie werden mit einem Standard-Vollblutbild bestimmt. Fäkales Lactoferrin wird durch einen ELISA-Test dosiert, der polyklonale Kaninchen-Antikörper verwendet, die spezifisch für menschliches Lactoferrin auf gefrorenen Stuhlproben sind.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wird unter Verwendung von Windows Microsoft Excel und einer Software Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.) durchgeführt. Kontinuierliche Daten werden als Median (Bereich) ausgedrückt; dichotome Daten werden als Häufigkeit und Anteil ausgedrückt. Es werden nichtparametrische Tests verwendet. Die Korrelation zwischen Bakterienstämmen und Entzündungsparametern wird mit dem Spearman-Test berechnet, um die ätiopathogenetische Rolle jedes Stamms zu bewerten. Der relevante Korrelationskoeffizient muss mindestens 0,50 betragen, und bei Festlegung eines zweiseitigen statistischen Signifikanzniveaus von 0,05 und einer Power von 0,20 muss die daraus folgende Stichprobengröße mindestens 29 Patienten betragen. Der Vergleich zwischen Pouchitis und gesunder Pouch wird mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Stellen Sie ein statistisches Signifikanzniveau auf 0,05 und eine Aussagekraft auf 0,20 ein. Die daraus folgende für den Vergleich erforderliche Stichprobengröße beträgt 16 Patienten für jede Gruppe. Abschließend werden mindestens 32 Patienten in diese Studie aufgenommen. Die statistische Signifikanz wird auf p < 0,05 festgelegt.