Mikrobiota i mikrośrodowisko immunologiczne w zapaleniu torebki (MEP1)

Cele studiów

Hipotezą roboczą jest to, że zakłócenie homeostazy mikroflory jelitowej, spontaniczne lub spowodowane deregulacją mechanizmu odporności wrodzonej w błonie śluzowej torebki, przyczynia się do wystąpienia przewlekłego/nawrotowego zapalenia zbiornika. Biorąc pod uwagę, że bakteryjną kolonizację błony śluzowej torebki można idealnie badać od momentu jej powstania, można to uznać za idealny model do badania wzajemnego oddziaływania między mikrobiomem jelitowym a wrodzonym układem odpornościowym. Dlatego celem tej Jednostki Badawczej jest ustalenie, w jaki sposób powstaje dysbioza i dysfunkcja mechanizmu odporności wrodzonej oraz w jaki sposób ta dysfunkcja przyczynia się do wystąpienia i utrzymania zapalenia zbiornika. Aby zająć się tymi istotnymi problemami patofizjologicznymi w świetle ich implikacji terapeutycznych, planujemy przeprowadzić randomizowane badanie z podwójnie ślepą próbą probiotyków w porównaniu z placebo u pacjentów, którzy zostaną poddani kolektomii, a następnie zespoleniu kieszonki jelita krętego z odbytem, ​​w celu włączenia pacjentów w czasie ileostomii do :

1. ocena składu i właściwości patogennych mikrobiomu zasiedlającego błonę śluzową kieszonki po zamknięciu ileostomii;
2. określić, w jaki sposób ekspresja i stan aktywacji wrodzonego układu odpornościowego w różnych typach komórek i obszarach anatomicznych błony śluzowej worka mają związek z zamknięciem ileostomii;
3. obserwacja wyników klinicznych woreczków odbytu w świetle interakcji między mikrobiomem a wrodzonym układem odpornościowym.

Projekt badania W okresie dwóch lat obliczyliśmy, aby włączyć co najmniej 32 pacjentów, którzy zostaną losowo przydzieleni przy zamknięciu ileostomii do grupy otrzymującej placebo (16 pacjentów) oraz do grupy otrzymującej doustną suplementację Lactobacillus casei GD przez 8 tygodni (16 pacjentów). Próbki błony śluzowej zostaną pobrane przy zamknięciu ileostomii i podczas endoskopii worka po 8 tygodniach i po 12 miesiącach. Za kwalifikujących się kandydatów weźmiemy wszystkich pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, którzy zostaną poddani proktokolektomii odtwórczej z zespoleniem worka odbytu w jelicie krętym i którzy będą zgłaszać się do naszej poradni na rutynowe badania endoskopowe i obserwacja kliniczna. Pacjenci z zapaleniem mankietów (zapalenie pozostałości błony śluzowej odbytu) lub chorobą Leśniowskiego-Crohna kieszonki (z przetokami okołoodbytniczymi lub zapaleniem doprowadzającej kończyny krętej), a także pacjenci, którzy otrzymywali antybiotyk lub probiotyk w ciągu ostatnich 30 dni, będą wykluczony z badania. Pacjenci z PDAI>7 będą uważani za jawne zapalenie zbiornika. Protokół będzie zgodny z zasadami zmienionej Deklaracji Helsińskiej.

Każdy pacjent otrzyma szczegółowe informacje o celach i metodologii badania oraz zostanie poproszony o pisemną, świadomą zgodę przed włączeniem do badania. W tym okresie pacjenci zostaną poproszeni o wykonanie endoskopii workowej z biopsją błony śluzowej, pobraniem kału i krwi w trzech następujących terminach: a) przed zamknięciem ileostomii, b) 2 miesiące po zamknięciu ileostomii, c) 12 miesięcy po zamknięciu ileostomii (lub wcześniej, w przypadku przypadku jawnego zapalenia zbiornika). Na podstawie kryteriów klinicznych, endoskopowych, histologicznych oraz PDAI ocenimy nasilenie choroby [5]. Na podstawie histologicznego i endoskopowego ostrego stanu zapalnego, jak również objawów klinicznych, pacjenci z całkowitym PDAI >7 zostaną sklasyfikowani jako cierpiący na ostre zapalenie zbiornika.

Endoskopia worka zostanie przeprowadzona bez sedacji. Pętla doprowadzająca, woreczek zostaną dokładnie zbadane i pobrane zostaną próbki do biopsji: dwie próbki do charakterystyki mikrobiomu, dwie do konwencjonalnej histologii, cztery do biologii molekularnej i analizy cytofluorymetrycznej. Biopsje będą przetwarzane i przechowywane zgodnie z różnymi badaniami.

Ocena mikrobiomu:

Aby scharakteryzować bakterie przylegające do kieszonki, biopsje błony śluzowej kieszonki jelita krętego zostaną natychmiast delikatnie przemyte w celu usunięcia luźno przylegających drobnoustrojów, a następnie zamrożone w ciekłym azocie w celu późniejszej ekstrakcji DNA, lub umieszczone w pożywce tioglikolowej w celu zachowania drobnoustrojów beztlenowych do kolejnych hodowli.

Względna obfitość typów bakterii w próbkach kału zostanie oszacowana przez sekwencjonowanie amplikonów PCR ukierunkowanych na gen 16S rRNA dla próbek DNA wyekstrahowanych z każdej próbki kału. PCR zostanie przeprowadzony przy użyciu zestawu starterów (784F: 5′-AGGATTAGATACCCTGGTA-3′ i 1061R: 5′-CRRCACGAGCTGACGAC-3′), który celuje w region V5-V6 genów 16S rRNA [38]. Aby powielić docelowy region, 1 μl wyekstrahowanego DNA posłuży jako matryca w 50 μl reakcji przy użyciu premiksu Prime STAR HS (Takara Bio Inc., Japonia). Produkty z dwóch rekondycjonujących reakcji PCR na próbkę zostaną połączone i oczyszczone przy użyciu kolumn do oczyszczania QIAquick PCR (Qiagen). Zamplifikowane produkty PCR zostaną użyte jako matryca do pirosekwencjonowania na platformie GS Junior (454 Life Sciences). Pirosekwencjonowanie zostanie przeprowadzone zgodnie z instrukcją producenta przy użyciu znaczników MID. Spodziewamy się uzyskać średnio około 15 000 sekwencji dla każdej próbki. Uzyskane dane zostaną poddane analizie danych przeprowadzonej za pomocą narzędzi obliczeniowych. Typowanie bakteryjnego rRNA zostanie przeprowadzone za pomocą wyszukiwania BLASTN w obszernej bazie danych rRNA „silva” wydanie 94 [39] przy użyciu progu wartości E <1E-40. Wszystkie gatunki bakterii uzyskane z każdej próbki kału zostaną sklasyfikowane do ich grup filogenetycznych i oszacowany zostanie udział różnych typów. Oszacowanie operacyjnej jednostki taksonomicznej (OTU) zostanie przeprowadzone przez program ESPRIT przy ustawieniach domyślnych [40].

W przypadku hodowli mikrobiologicznych biopsje natychmiast umieszczone w podłożu tioglikolowym (w celu ochrony drobnoustrojów beztlenowych przed ekspozycją na tlen) będą dalej przetwarzane w kapturze beztlenowym wypełnionym atmosferą C02:H2 (95:5). Biopsje zostaną przemyte sterylnym roztworem soli nasyconej barwnikiem gazowym z dodatkiem 0,016% ditioerytrytolu w celu usunięcia śluzu i po hipotonicznej lizie komórek w sterylnej wodzie, posiane na odpowiednich płytkach agarowych w celu oceny mikroflory powierzchniowej. [35]. Próbki zostaną wysiane na podłożu nieselektywnym (Brain Heart Infusion Agar, BHA) i selektywnym dla Enterobacteriacae spp (agar MacConkey) i Lactobacillus spp (agar Rogosa SL).

Płytki z agarem BHA i MacConkey będą hodowane w warunkach beztlenowych i tlenowych (odpowiednio 24 i 72 godziny), podczas gdy płytki z agarem Rogosa SL Agar będą hodowane tylko w warunkach beztlenowych (72 godziny) w temperaturze 37°C. Kolonie zostaną policzone, pogrupowane na podstawie wyglądu morfologicznego i poddane analizie morfologicznej metodą barwienia metodą Grama (Biolife S.r.l.). Następnie drobnoustroje zostaną poddane charakteryzacji molekularnej, przeprowadzonej poprzez sekwencjonowanie amplikonów PCR 16S rRNA przy użyciu zestawu „Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” [24]. Izolaty będą dalej scharakteryzowane zgodnie z ich potencjałem chorobotwórczym (tj. profil toksyczności i oporność na antybiotyki).

Wrodzone środowisko odpornościowe błony śluzowej

Analiza sieci zapalnej w błonie śluzowej kieszonki będzie obejmowała

1. oznaczenie ilościowe cytokin [IL-1β, IL-6, TNF-, TGFβ, IL-10 i IL-4 oraz chemokin [MCP1,] za pomocą testu immunologicznego na cytokiny Bio-Plex. Jedna biopsja zostanie poddana homogenizacji, a klarowny supernatant zostanie wykorzystany do współczesnego oznaczania ilościowego wielu cytokin i chemokin za pomocą specjalnie zaprojektowanych testów;
2. analiza sieci TLR (kwantyfikacja mRNA i dystrybucja białek) za pomocą odpowiednio ilościowej RT-PCR i immunohistochemii;
3. ocena stanu aktywacji makrofagów, komórek dendrytycznych, naciekających limfocytów ocena markerów powierzchniowych (tj.) i cytokin wewnątrzkomórkowych (tj. TNF, IFN, IL4, IL10) za pomocą analizy cytofluorymetrycznej. Dwie biopsje zostaną poddane delikatnemu trawieniu enzymatycznemu, a następnie wybarwione odpowiednio znakowanymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom powierzchniowym lub cytokinom wewnątrzkomórkowym.

Działanie przeciwdrobnoustrojowe błony śluzowej. Aby scharakteryzować antybakteryjną sieć peptydową w błonie śluzowej torebki, odpowiedzialną za kształtowanie przylegającej mikroflory, a) określimy przeciwdrobnoustrojowe właściwości ekstraktów śluzówkowych, przeprowadzając test toksyczności przeciwbakteryjnej in vitro [37]; b) oznaczać ilościowo defensyny przeciwdrobnoustrojowe pochodzące z nabłonka i leukocytów (takie jak Def2, Def3; DEFA5; DEFA6) za pomocą ilościowej reakcji RT-PCR.

Ocena histologiczna:

Do rutynowego badania histologicznego dwie biopsje zostaną utrwalone w 4% PFA na 24 godziny, następnie odwodnione i zatopione w parafinie, a skrawki (o grubości 5 μm) zostaną pocięte i poddane standardowemu wybarwieniu hematoksyliną/eozyną (H&E). Do ilościowego określenia nasilenia stanu zapalnego zostaną wykorzystane badania Florena i in. wynik [41].

Ocena zapalenia ogólnoustrojowego i jelitowego

Ogólnoustrojowy i miejscowy stan zapalny będzie oceniany na każdej linii czasowej eksperymentu na podstawie odpowiednio: szybkości sedymentacji erytrocytów (ESR), liczby białych krwinek (WBC), liczby płytek krwi (PLT), CRP i laktoferyny w kale. ESR będzie mierzona metodą Westergren. CRP zostanie wykryte za pomocą immunonefelometrii (prawidłowe: <6 mg/l; patologiczne >6 mg/l). Białko całkowite i albuminy będą oznaczane metodą biuretową. WBC, liczba płytek krwi i hemoglobinemia zostaną uzyskane za pomocą standardowej pełnej morfologii krwi. Laktoferyna kałowa zostanie dozowana za pomocą testu ELISA, który wykorzystuje królicze przeciwciała poliklonalne specyficzne dla ludzkiej laktoferyny na zamrożonych próbkach kału.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu programu Windows Microsoft Excel i oprogramowania Statistica 7.1 (Statsoft, Inc.). Dane ciągłe zostaną wyrażone jako mediana (zakres); dane dychotomiczne zostaną wyrażone jako częstotliwość i proporcja. Zastosowane zostaną testy nieparametryczne. Korelacja między szczepami bakterii a parametrami stanu zapalnego zostanie obliczona za pomocą testu Spearmana w celu oceny etiopatogenetycznej roli każdego szczepu. Odpowiedni współczynnik korelacji nie będzie mniejszy niż 0,50, a przyjmując poziom istotności statystyki dwustronnej na poziomie 0,05 i moc na poziomie 0,20, wynikająca z tego wielkość próby będzie musiała wynosić co najmniej 29 pacjentów. Porównanie między zapaleniem torebki a zdrową torebką zostanie przeprowadzone za pomocą testu U Manna-Whitneya. Ustaw poziom istotności statystycznej na 0,05 i moc na 0,20, a wynikająca z tego wielkość próby wymagana do porównania będzie wynosić 16 pacjentów dla każdej grupy. Podsumowując, do tego badania zostanie włączonych co najmniej 32 pacjentów. Istotność statystyczna zostanie ustalona na p<0,05.