낭염에서의 미생물군과 면역 미세환경 (MEP1)

연구 목적

작업 가설은 자발적이거나 주머니 점막 내 선천성 면역 기구의 규제 완화로 인한 장내 미생물 항상성 파괴가 만성/재발성 낭염의 발병에 기여한다는 것입니다. 파우치 점막의 세균 집락화는 그 세대부터 이상적으로 연구될 수 있다는 점을 고려할 때, 이것은 장내 미생물과 선천적 면역 체계 사이의 상호 작용을 연구하는 이상적인 모델로 간주될 수 있습니다. 따라서 이 연구 단위의 목표는 세균불균형과 선천성 면역 기계 기능 장애가 어떻게 확립되고 이 기능 장애가 낭염의 시작과 유지에 어떻게 기여하는지를 규명하는 것입니다. 치료적 의미에 비추어 이러한 관련 병태생리학적 문제를 해결하기 위해, 우리는 결장절제술 및 후속 회장주머니-항문 문합을 시행할 환자를 대상으로 무작위 이중 맹검 연구 프로바이오틱스 대 위약을 수행하여 회장루 수술 시 환자를 등록할 계획입니다. :

1. ileostomy 폐쇄 후 주머니 점막을 식민지화하는 미생물의 구성 및 병원성 특성을 평가합니다.
2. 다양한 세포 유형 및 파우치 점막의 해부학적 영역에서 선천성 면역 시스템의 발현 및 활성화 상태가 회장루 폐쇄와 어떻게 관련되는지 결정합니다.
3. microbiota-innate 면역 체계 상호 작용에 비추어 항문 주머니의 임상 결과를 추적하십시오.

연구 설계 2년 동안 위약을 투여받은 그룹(16명의 환자)과 8주 동안 락토바실러스 카제이 GD 경구 보충을 받은 그룹(16명의 환자)에서 회장루 폐쇄 시 무작위 배정될 최소 32명의 환자를 등록하도록 계산했습니다. 점막 샘플은 ileostomy closure 및 8주 및 12개월에 파우치 내시경 검사에서 수확됩니다. 우리는 회장 주머니 항문 문합으로 회복 직장 결장 절제술을 받고 일상적인 내시경 검사 및 임상 추적. 커프염(직장 점막 잔여물의 염증) 또는 주머니의 크론병(항문주위 누공 또는 구심성 회장지의 염증)이 있는 환자 및 이전 30일 동안 항생제 또는 프로바이오틱스 요법을 받은 환자는 연구에서 제외됩니다. PDAI>7인 환자는 현성 낭염으로 간주됩니다. 의정서는 수정된 헬싱키 선언의 원칙을 준수합니다.

각 환자에게는 연구 목적과 방법론에 대한 자세한 정보가 제공되며 등록 전에 사전 서면 동의를 받도록 요청할 것입니다. 이 기간 동안 환자는 a) 회장루 폐쇄 전, b) 회장루 폐쇄 후 2개월, c) 회장루 폐쇄 후 12개월(또는 명백한 주머니염의 경우). 임상, 내시경 및 조직학적 기준과 PDAI를 기반으로 질병의 중증도를 평가합니다[5]. 조직학적 및 내시경적 급성 염증 및 임상 증상을 기반으로 총 PDAI>7인 환자는 급성 주머니염으로 분류됩니다.

파우치 내시경 검사는 진정제 없이 시행됩니다. 구심성 루프, 파우치를 주의 깊게 검사하고 생검 샘플링을 수행할 것입니다: 미생물 특성화를 위한 2개 샘플, 기존 조직학을 위한 2개 샘플, 분자 생물학 및 세포형광 분석을 위한 4개 샘플. 생검은 다른 연구에 따라 처리되고 저장됩니다.

미생물총 평가:

회장 주머니에서 파우치 점막 생검에 부착된 박테리아를 특성화하려면 느슨하게 부착된 미생물을 제거하기 위해 즉시 부드럽게 세척한 다음 후속 DNA 추출을 위해 액체 질소에서 동결하거나 후속 배양을 위해 혐기성 미생물을 보존하기 위해 티오글리콜레이트 배지에 배치합니다.

각 대변 표본에서 추출한 DNA 샘플에 대해 16S rRNA 유전자를 표적으로 하는 PCR 앰플리콘의 시퀀싱을 통해 대변 표본 내 박테리아 문의 상대적 풍부도를 추정할 것입니다. PCR은 16S rRNA 유전자의 V5-V6 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트(784F: 5'-AGGATTAGATACCCTGGTA-3' 및 1061R: 5'-CRRCACGAGCTGACGAC-3')를 사용하여 수행될 것입니다[38]. 표적 영역을 증폭하기 위해 Prime STAR HS 프리믹스(Takara Bio Inc., 일본)를 사용하여 추출된 DNA 1μl를 50μl 반응에서 주형으로 사용합니다. QIAquick PCR 정제 컬럼(Qiagen)을 사용하여 검체당 2개의 재조정 PCR 반응 제품을 결합하고 정제합니다. 증폭된 PCR 산물은 GS Junior 플랫폼(454 Life Sciences)과 함께 파이로시퀀싱을 위한 템플릿으로 사용될 예정입니다. 파이로시퀀싱은 MID 태그를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다. 평균적으로 각 샘플에 대해 약 15,000개의 서열을 얻을 것으로 예상합니다. 얻은 데이터는 전산 도구에 의해 수행된 데이터 분석의 대상이 됩니다. 박테리아 rRNA 타이핑은 E-값 <1E-40의 임계값을 사용하여 포괄적인 rRNA 데이터베이스 "silva" 릴리스 94[39]에 대한 BLASTN 검색에 의해 수행됩니다. 각 대변 샘플에서 얻은 모든 박테리아 종은 계통 발생 그룹으로 분류되고 서로 다른 문(phyla)의 비율이 추정됩니다. 작동 분류 단위(OTU)의 추정은 기본 설정[40]을 사용하여 ESPRIT 프로그램에 의해 수행됩니다.

미생물 배양의 경우 티오글리콜산 배지에 즉시 배치된 생검(산소 노출로부터 혐기성 미생물을 보호하기 위해)은 C02:H2(95:5) 분위기로 채워진 혐기성 후드에서 추가로 조작됩니다. 생검은 점액을 제거하기 위해 0.016% 디티오에리트리톨이 보충된 멸균 염료 가스 식염수 용액으로 세척하고 표층 미생물을 평가하기 위해 적절한 한천 플레이트에 접종한 멸균수에서 세포 저장성 용해를 수행합니다. [35]. 샘플은 비선택적(Brain Heart Infusion Agar, BHA) 및 Enterobacteriacae spp(MacConkey agar) 및 Lactobacillus spp(Rogosa SL agar)에 대한 선택적 배지에 시딩됩니다.

BHA 및 MacConkey 한천 플레이트는 혐기성 및 호기성 조건(각각 24 및 72시간)에서 배양되는 반면 Rogosa SL Agar 플레이트는 37°C의 혐기성 조건(72시간)에서만 배양됩니다. 콜로니를 계수하고, 형태학적 외관을 기준으로 그룹화하고, 그람 염색(Biolife S.r.l.)에 의해 형태학적 분석을 수행합니다. 그런 다음 미생물은 "Abi Prism TM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" [24]를 사용하여 16S rRNA의 PCR 앰플리콘을 시퀀싱하여 수행되는 분자 특성 분석을 받게 됩니다. 분리물은 잠재적인 병원성(즉, 독성 프로필 및 항생제 내성).

점막 선천성 면역 환경

파우치 점막의 염증 네트워크 분석에는 다음이 포함됩니다.

1. Bio-Plex 사이토카인 면역측정법에 의한 사이토카인[IL-1ß, IL-6, TNF- , TGF ß, IL-10 및 IL-4 및 케모카인[MCP1,] 수준의 정량화. 하나의 생검을 균질화하고 투명한 상청액을 맞춤 설계된 분석법으로 다중 사이토카인 및 케모카인의 현대적 정량화에 사용합니다.
2. 각각 정량적 RT-PCR 및 면역조직화학에 의한 TLR 네트워크 분석(mRNA 정량 및 단백질 분포);
3. 대식세포, 수지상 세포, 표면 마커(예:) 및 세포내 사이토카인 패턴(예: TNF , IFN , IL4, IL10) 세포형광 분석에 의해. 2개의 생검은 부드러운 효소 소화를 거친 다음 표면 항원 또는 세포내 사이토카인에 대한 적절하게 표지된 항체로 염색됩니다.

점막 항균 활성. 부착성 미생물군 형성을 담당하는 주머니 점막의 항박테리아 펩타이드 네트워크를 특성화하기 위해 우리는 a) 체외 항박테리아 독성 분석을 수행하여 점막 추출물의 항미생물 특성을 결정합니다[37]. b) 정량적 RT-PCR에 의해 상피 및 백혈구 유래 항미생물 디펜신(예: Def2, Def3; DEFA5; DEFA6)을 정량화합니다.

조직학적 평가:

일상적인 조직학적 검사를 위해 2개의 생검을 24시간 동안 4% PFA에 고정한 다음 탈수하고 파라핀에 포매하고 절편(두께 5μm)을 절단하여 표준 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색을 실시합니다. 염증 중증도를 정량화하기 위해 Floren et al. 점수 [41].

전신 및 장 염증 평가

전신 및 국소 염증 상태는 각각의 실험 타임라인에서 적혈구 침강 속도(ESR), 백혈구 수(WBC), 혈소판 혈구 수(PLT), CRP 및 분변 락토페린에 의해 각각 평가될 것이다. ESR은 Westergren 방법으로 측정됩니다. CRP는 면역 혼탁법으로 검출됩니다(정상: <6 mg/l; 병리학적 >6mg/l). 총 단백질 및 알부민은 뷰렛 방법으로 평가됩니다. WBC, 혈소판 수 및 혈색소 혈증은 표준 전혈 세포 수로 얻어집니다. 분변 락토페린은 냉동 대변 샘플에서 인간 락토페린에 특이적인 토끼 다클론 항체를 사용하는 ELISA 테스트에 의해 투여될 것입니다.

통계 분석

Windows Microsoft Excel 및 Statistica 7.1(Statsoft, Inc.) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 연속 데이터는 중앙값(범위)으로 표시됩니다. 이분법 데이터는 빈도와 비율로 표현됩니다. 비모수 테스트가 사용됩니다. 박테리아 균주와 염증 매개변수 사이의 상관관계는 각 균주의 병인-병원성 역할을 평가하기 위해 Spearman 테스트로 계산됩니다. 관련 상관 계수는 0.50보다 열등하지 않을 것이며 양측 통계적 유의 수준을 0.05로 설정하고 검정력을 0.20으로 설정하면 결과 표본 크기는 최소 29명의 환자여야 합니다. 낭염과 건강한 낭의 비교는 Mann-Whitney U 검사로 수행됩니다. 통계적 유의 수준을 0.05로 설정하고 검정력을 0.20으로 설정합니다. 비교에 필요한 결과 샘플 크기는 각 그룹에 대해 16명의 환자가 됩니다. 결론적으로 최소 32명의 환자가 이 연구에 등록될 것입니다. 통계적 유의성은 p<0.05로 설정됩니다.