COVID-19患者の唾液中のウイルス量を減少させるための市販のうがい薬によるうがい薬の有効性の評価

唾液中のウイルス量を減らす戦略は、SARS-CoV-2 の伝染のリスクを減らすことに貢献する可能性があります。 したがって、殺ウイルス活性を持つ消毒剤を含むうがい薬の使用は、一般集団に簡単に適用できる単純で低コストの予防戦略になる可能性があります. 唾液サンプル中の in vivo での SARS-CoV-2 ウイルス負荷を中和または減少させるいくつかの消毒薬の効果を評価するために、多施設、無作為化、盲検、4 並列群、プラセボ対照試験が設計されました。

この研究は、マドリードの 3 つの異なる病院で実施されます。Fundación Jiménez Díaz University Hospital (マドリード、スペイン)、Villalba University General Hospital (マドリード、スペイン)、Infanta Elena University Hospital (マドリード、スペイン) です。

含まれるすべての患者は、SARS-COV-2感染のために以前に診断され、入院しており、主に呼吸器の病理のために入院しています。 それらのすべては成人 (年齢 > 18 歳) であり、病院の倫理委員会の勧告に従って、参加に対して自発的な書面または口頭の同意を提供します。

同意の承認後、介入を担当する病院スタッフは、以前にランダムに生成されたテーブルからの順序に従って、各参加者にコードを連続的に割り当てます。 コードは、患者番号と 4 つの研究グループ (A、B、C、D) のいずれかに対応する文字で構成され、臨床担当者には知られていますが、サンプルを処理して RNA を抽出する検査室の担当者には知られていません。 、およびデータを分析する人に。 このようにして、参加者は 4 つの治療グループのいずれかにランダムに割り当てられ、うがい薬とプラセボの両方に同じ容量の同一のチューブを使用することでブラインドが達成されます。

対象となるすべての患者は、サンプル採取の 1 時間前から、飲食、水以外の飲み物、ガムを噛む、喫煙する、歯を磨く、またはマウスウォッシュを使用しないように求められます。 さらに、マウスウォッシュ後 30 分間は飲酒が禁止されており、試験中は食事が禁止されています。

4 つのマウスウォッシュがランダム化されています。リンスは、市販のフォーミュラですぐに使用できます。 すべてのうがい薬は、安全と分類された市販品です。

合計 4 つの刺激されていない唾液サンプルを患者ごとに収集します。1 つは基礎、3 つはマウスウォッシュ後、それぞれ 5 分、15 分、および 60 分です。 各参加者は、少なくとも 2 mL の 4 つの唾液サンプルを寄付するように求められました。1 つはベースラインでのすすぎ前、もう 3 つは洗口後 5、15、および 60 分です。 患者から提供された各サンプルは、喀痰後に得られた分泌物を無菌のミリメートルプラスチックチューブに捨てて、垂下法を​​使用して収集されました。 ベースラインの唾液サンプルを採取した後 (プレリンス、t0)、各患者は無作為化されたマウスウォッシュ (15 mL) で 1 分間すすがれました。 患者は、飲み込んだりうがいをしたりせずに、うがい薬がすべての歯、歯肉、口蓋、舌に確実に届くように指示されました. すすぎの５分後（ｔ５'）、１５分後（ｔ１５'）および６０分後（ｔ６０'）に、サンプル当たり少なくとも２ｍＬの唾液が採取された。 唾液サンプルが必要な 2 mL に達したら、プラスチック チューブに患者に割り当てられたコードと時点を示すラベルを付け、-80 ℃ で密閉して保管しました。 すべてのサンプルは、UN3733 規格に従って、ドライアイス上でバイオセーフティ レベル 3 (BSL-3) 研究所 (FISABIO-Public Health) に移されました。

FISABIO-Public Health の BSL-3 実験室で、サンプルを室温で解凍し、それぞれの 200 uL アリコートを RNA 抽出に使用しました。 各サンプルの残りの量は、Vero-E6 細胞株でさらにテストするまで、-80℃ですぐに保存されました。 RNA 抽出では、最初にプロテイナーゼ K (Epicentre) を使用して 56 °C で 20 分間溶解を行い、続いて完全に自動化された eMAG プラットフォーム (bioMérieux、フランス) を使用して、唾液サンプルの製造元の指示に従って溶解を行いました。 次に、SARS-CoV-2 E 遺伝子を検出するために、WHO-Charité および米国 CDC アッセイ (13,14) に基づいて、サンプルおよび抽出コントロールとしてのヒト RNAse-P 遺伝子とともに、マルチプレックス RT-qPCR テストを実行しました。 Ferrer et al.(15) によって記述されたプロトコルの詳細に従ってください。 マルチプレックス RT-qPCR では、抽出した RNA のサンプルあたり 2 回の複製を行いました。 結果は、唾液 1 mL あたりのウイルス コピーに対して正規化されました。

Vero-E6 細胞の唾液サンプルからの SARS-CoV-2 培養では、Vero-E6 細胞 (ATCC) は、Sánchez Barrueco らによって記述されたプロトコルの詳細に従って、補足された DMEM (Biowest) で培養されました (15)。

１×ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１：１に希釈した唾液サンプルを遠心分離し（１２，０００ｇで５分間）、３００μＬの上清を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の１．５×１０ ５ Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞と１分間インキュベートした。生きたウイルスを吸収させるために、37℃で1時間。 次に、唾液 (吸収されなかったウイルスを含む) を除去し、500 uL の感染培地 (トリプシン TPCK 6 μg/ml (Biowest) を添加した DMEM を補充) で置き換え、37°C​​、5% CO2 で 5 日間インキュベートしました。 感染から 5 日後、eMAG プラットフォームの指示に従って両方の上清を RNA 抽出用に収集し、細胞変性効果 (CPE) を陰性または陽性として記録しました (14)。 CPE は、ポジティブ コントロール (SARS-CoV-2 ストック ウイルス (MAD-6 株、1.33 TCID50/mL、CNB-CSIC、スペイン) 300 uL を播種した細胞) では明らかでしたが、ネガティブ コントロール (PBS 300 uL を播種した細胞) には存在しませんでした。唾液中のウイルス負荷に応じて、唾液サンプルを播種した細胞の変数。 5 日目の培養上清中の RT-qPCR Ct 値が < 37 (≥ 2x103 SARS-CoV-2 コピー/mL に相当) の場合、培養は陽性と見なされました。

実施される分析に関して、この研究の主な目的は、生体内でテストされた唾液中の SARS-Cov2 ウイルス負荷に対するさまざまなマウスウォッシュの効果を判断することです。 したがって、主要な結果は、各治療におけるベースラインとマウスウォッシュ後の 3 つの時点の間の唾液中のウイルス量の生存率の変化になります。 さらに、年齢、性別、症状の出現からの日数、鼻咽頭サンプルの PCR によって決定された患者のウイルス陽性からの日数など、収集されたさまざまな臨床データを使用して、洗浄前の基礎ウイルス量と生存率との相関関係も明らかになります。勉強する。 最後に、カテゴリ別の臨床変数と、異なる治療法で異なる時期にウイルス量と生存率が改善する患者の頻度との間の可能な関連性が評価されます。

ベースラインの唾液サンプルが各患者の対照と見なされると仮定すると、研究者は、20% を超えるグループ間の有意差を特定するために、アームあたり 5 人の患者 (CHX 0.12%、CHX 0.2%、Cym ZnCl2 およびプラセボ) に到達することを検討しました。 0.05 の Cronbach のアルファ、0.8 の累乗、ドロップアウトまたは不十分なウイルス負荷による 10% の可能なドロップアウト率で、22 人の患者の最小サンプルサイズが計算されました。

Wilcoxon 検定を使用して、試験時点 (ベースラインと 5、15、および 60 分後) 間および異なるマウスウォッシュまたは試験アーム間の平均差を評価しました。 スピアマンの相関分析は、臨床変数とベースラインの唾液中ウイルス量、生存負荷、または鼻咽頭ウイルス量との関係を評価するために実施されました。 すべての計算とテストは、R ソフトウェア (バージョン 3.6.3、 「統計」パッケージ)