Оценка эффективности полосканий рта коммерческими ополаскивателями для снижения вирусной нагрузки в слюне у пациентов с COVID-19

Стратегии снижения вирусной нагрузки в слюне могут способствовать снижению риска передачи SARS-CoV-2. Таким образом, использование жидкостей для полоскания рта с антисептиками, обладающими вирулицидной активностью, может быть простой и недорогой профилактической стратегией, которую можно легко применять среди населения в целом. Чтобы оценить влияние нескольких антисептиков на нейтрализацию или снижение вирусной нагрузки SARS-CoV-2 in vivo в образцах слюны, было разработано многоцентровое рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование с четырьмя параллельными группами.

Исследование будет проводиться в Мадриде, в трех различных больницах: Университетской больнице Fundación Jiménez Díaz (Мадрид, Испания), Университетской больнице общего профиля Вильяльба (Мадрид, Испания) и Университетской больнице Инфанты Елены (Мадрид, Испания).

Каждый включенный пациент ранее диагностирован и госпитализирован по поводу инфекции SARS-COV-2, госпитализирован в основном по поводу респираторной патологии. Все они будут взрослыми (возраст >18 лет) и предоставят свое добровольное письменное или устное согласие на участие в соответствии с рекомендациями комитета по этике больницы.

После утверждения согласия персонал больницы, ответственный за вмешательства, последовательно присваивает каждому участнику код в соответствии с порядком из ранее случайно сгенерированной таблицы. Код будет состоять из номера пациента и буквы, соответствующей одной из четырех групп исследования (A, B, C и D), которые будут известны клиническому персоналу, но неизвестны персоналу лаборатории, который будет обрабатывать образцы и выделять РНК. , а также тем, кто будет анализировать данные. Таким образом, участники будут случайным образом распределены в одну из четырех групп лечения, а слепые будут достигнуты за счет использования идентичных пробирок с одинаковым объемом как для полоскания рта, так и для плацебо.

Каждого включенного пациента просят не есть, не пить ничего, кроме воды, жевать жевательную резинку, курить, чистить зубы или использовать какие-либо жидкости для полоскания рта в течение одного часа до сбора образцов. Кроме того, им нельзя пить в течение получаса после полоскания рта и есть на протяжении всего теста.

Четыре ополаскивателя рандомизированы: ополаскиватели готовы к использованию в своих коммерческих рецептурах. Все жидкости для полоскания рта являются коммерческими продуктами, классифицируемыми как безопасные.

Всего у каждого пациента будет взято 4 нестимулированных образца слюны: один исходный и три после полоскания рта, через 5 минут, через 15 минут и через 60 минут соответственно. Каждому участнику было предложено сдать четыре образца слюны объемом не менее 2 мл: один на исходном уровне перед полосканием рта и три других через 5, 15 и 60 минут после полоскания рта. Каждый образец, предоставленный пациентом, был собран с использованием техники слюнотечения, отбрасывая выделения, полученные после отхаркивания, в стерильную миллиметровую пластиковую пробирку. После сбора исходного образца слюны (предварительное полоскание, t0) каждый пациент полоскал полоскание рта случайным образом (15 мл) в течение одной минуты. Пациент был проинструктирован следить за тем, чтобы жидкость для полоскания рта достигала всех зубов, десен, неба и языка, не глотая и не полоская горло. Через 5 минут (t5'), 15 минут (t15') и 60 минут (t60') после полоскания, соответственно, на образец собирали не менее 2 мл слюны. После того, как были получены необходимые 2 мл образца слюны, пластиковая пробирка была маркирована кодом, присвоенным пациенту, и моментом времени, и хранилась герметично закрытой при температуре -80ºC. Все образцы были перенесены в лабораторию уровня биобезопасности 3 (BSL-3) (FISABIO-Public Health) на сухом льду в соответствии со стандартами UN3733.

В лаборатории BSL-3 FISABIO-Public Health образцы размораживали при комнатной температуре, и аликвоту по 200 мкл каждого из них использовали для выделения РНК. Оставшийся объем каждого образца немедленно хранили при -80°С до дальнейшего тестирования на клеточных линиях Vero-E6. Для выделения РНК сначала проводили лизис протеиназой К (Epicentre) в течение 20 минут при 56°C, а затем на полностью автоматизированной платформе eMAG (bioMérieux, Франция) в соответствии с инструкциями производителя образцов слюны. Затем для обнаружения гена E SARS-CoV-2 был проведен мультиплексный тест RT-qPCR на основе анализов WHO-Charité и CDC США (13,14) вместе с геном РНКазы-P человека в качестве образца и контроля выделения. следуя деталям протокола, описанного Ferrer et al. (15). Для мультиплексной RT-qPCR выполняли два повтора на образец выделенной РНК. Результаты нормировали на количество копий вируса на мл слюны.

Для культивирования SARS-CoV-2 из образцов слюны в клетках Vero-E6 клетки Vero-E6 (ATCC) культивировали в среде DMEM с добавками (Biowest) в соответствии с подробностями протокола, описанного Санчесом Барруэко и др. (15).

Образцы слюны, разведенные 1:1 в 1X Dulbecco's PBS (Gibco), центрифугировали (5 минут при 12000 g) и 300 мкл супернатанта инкубировали в двух повторностях с 1,5x105 клеток Vero-E6 в 24-луночном планшете (Corning) в течение одной час при 37°C, чтобы обеспечить абсорбцию живых вирусов. Затем слюну (с неабсорбированными вирусами) удаляли и заменяли 500 мкл инфекционной среды (с добавлением DMEM с трипсином TPCK 6 мкг/мл (Biowest)) и инкубировали в течение 5 дней при 37°C и 5% CO2. Через 5 дней после инфицирования оба супернатанта собирали для выделения РНК в соответствии с инструкциями платформы eMAG, и цитопатический эффект (CPE) регистрировали как отрицательный или положительный (14). CPE был очевиден в положительных контрольных клетках, засеянных 300 мкл исходного вируса SARS-CoV-2 (штамм MAD-6, 1,33 TCID50/мл, CNB-CSIC, Испания), и отсутствовал в отрицательных контрольных клетках, засеянных 300 мкл PBS- и варьирует в клетках, засеянных образцами слюны, в зависимости от вирусной нагрузки в слюне. Культура считалась положительной, когда значение Ct RT-qPCR в супернатанте культуры на 5-й день было < 37 (эквивалентно ≥ 2x103 копий SARS-CoV-2/мл).

Что касается анализов, которые необходимо провести, то основной целью исследования является определение влияния различных жидкостей для полоскания рта на вирусную нагрузку SARS-Cov2 в слюне, протестированную in vivo. Таким образом, первичным результатом будет изменение жизнеспособности вирусной нагрузки слюны между исходным уровнем и тремя временными точками после полоскания рта при каждом лечении. Кроме того, будут также корреляции между базальной вирусной нагрузкой и жизнеспособностью до промывания с различными собранными клиническими данными, такими как возраст, пол, количество дней с момента появления симптомов и дней с момента положительного результата теста на вирус у пациентов, определенного с помощью ПЦР образцов из носоглотки. изучаться. Наконец, будут оценены возможные связи между категориальными клиническими переменными и частотой пациентов, у которых улучшается вирусная нагрузка и жизнеспособность в разное время для различных видов лечения.

Предполагая, что исходный образец слюны считается контролем для каждого пациента, исследователи решили охватить 5 пациентов в группе (CHX 0,12%, CHX 0,2%, Cym ZnCl2 и плацебо), чтобы выявить значительные различия между группами более 20%. При коэффициенте альфа Кронбаха 0,05, мощности 0,8 и 10% возможной частоте отсева из-за отсева или недостаточной вирусной нагрузки был рассчитан минимальный размер выборки из 22 пациентов.

Критерий Уилкоксона использовали для оценки средних различий между временными точками исследования (исходный уровень и через 5, 15 и 60 минут), а также между различными ополаскивателями для рта или группами исследования. Корреляционный анализ Спирмена проводился для оценки связи между клиническими переменными с исходной вирусной нагрузкой в ​​слюне, жизнеспособной нагрузкой или вирусной нагрузкой в ​​носоглотке. Все расчеты и тесты проводились с помощью программного обеспечения R (версия 3.6.3, пакет "статистика")