Évaluation de l'efficacité des bains de bouche avec des bains de bouche commerciaux pour réduire la charge virale dans la salive chez les patients COVID-19

Des stratégies de réduction de la charge virale salivaire pourraient contribuer à réduire le risque de transmission du SARS-CoV-2. Ainsi, l'utilisation de bains de bouche avec des antiseptiques ayant une activité virucide peut être une stratégie préventive simple et peu coûteuse qui pourrait facilement être appliquée dans la population générale. Pour évaluer l'effet de plusieurs antiseptiques pour neutraliser ou réduire la charge virale du SRAS-CoV-2 in vivo dans des échantillons de salive, un essai multicentrique, randomisé, en aveugle, en quatre groupes parallèles et contrôlé par placebo a été conçu.

L'étude sera réalisée à Madrid, dans trois hôpitaux différents : l'hôpital universitaire Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Espagne), l'hôpital général universitaire Villalba (Madrid, Espagne) et l'hôpital universitaire Infanta Elena (Madrid, Espagne).

Chaque patient inclus est préalablement diagnostiqué et hospitalisé en raison d'une infection par le SRAS-COV-2, étant admis principalement pour une pathologie respiratoire. Tous seront des adultes (âge > 18 ans) et fourniront leur consentement volontaire écrit ou oral à la participation conformément aux recommandations du comité d'éthique de l'hôpital.

Après approbation du consentement, le personnel hospitalier responsable des interventions attribuera consécutivement à chaque participant un code suivant l'ordre d'un tableau préalablement généré aléatoirement. Le code sera composé d'un numéro de patient et d'une lettre correspondant à l'un des quatre groupes d'étude (A, B, C et D), qui seront connus du personnel clinique mais inconnus du personnel de laboratoire qui traitera les échantillons et extraira l'ARN , ainsi qu'à ceux qui analyseront les données. De cette manière, les participants seront assignés au hasard à l'un des quatre groupes de traitement et l'aveugle sera atteint en utilisant des tubes identiques avec le même volume pour les bains de bouche et le placebo.

Chaque patient inclus est invité à ne pas manger, boire autre chose que de l'eau, mâcher de la gomme, fumer, se brosser les dents ou utiliser un rince-bouche pendant une heure avant le prélèvement de l'échantillon. De plus, ils ne sont pas autorisés à boire pendant une demi-heure après le bain de bouche et à manger pendant tout le test.

Quatre bains de bouche sont randomisés : les bains de bouche sont prêts à l'emploi dans leurs formules commerciales. Tous les bains de bouche sont des produits commerciaux classés comme sûrs.

Un total de 4 échantillons de salive non stimulés seront prélevés pour chaque patient : un basal et trois après le bain de bouche, respectivement à 5 minutes, à 15 minutes et à 60 minutes. Chaque participant a été invité à donner quatre échantillons de salive d'au moins 2 ml : un au départ avant le rinçage et trois autres à 5, 15 et 60 minutes après le bain de bouche. Chaque échantillon fourni par le patient a été collecté en utilisant la technique de bave, en jetant les sécrétions obtenues après expectoration dans un tube en plastique millimétrique stérile. Après avoir collecté l'échantillon de salive de référence (pré-rinçage, t0), chaque patient s'est rincé avec le rince-bouche randomisé (15 ml) pendant une minute. Le patient a été chargé de s'assurer que le rince-bouche atteint toutes les dents, les gencives, le palais et la langue, sans avaler ni se gargariser. A 5 minutes (t5'), 15 minutes (t15') et 60 minutes (t60') après le rinçage, respectivement, au moins 2 mL de salive ont été recueillis par échantillon. Une fois que les 2 ml requis d'échantillon de salive ont été atteints, le tube en plastique a été étiqueté avec le code attribué au patient et le moment, et maintenu hermétiquement fermé à -80 ° C. Tous les échantillons ont été transférés au laboratoire de niveau de biosécurité 3 (BSL-3) (FISABIO-Santé publique) sur de la neige carbonique selon les normes UN3733.

Dans le laboratoire BSL-3 de FISABIO-Public Health, les échantillons ont été décongelés à température ambiante et une aliquote de 200 uL de chacun a été utilisée pour l'extraction de l'ARN. Le volume restant de chaque échantillon a été immédiatement stocké à -80°C jusqu'à d'autres tests dans des lignées cellulaires Vero-E6. Pour l'extraction de l'ARN, premièrement, la lyse a été réalisée avec la protéinase K (Epicentre) pendant 20 minutes à 56°C suivie de la plateforme entièrement automatisée eMAG (bioMérieux, France) selon les instructions du fabricant pour les échantillons de salive. Ensuite, pour détecter le gène SARS-CoV-2 E, un test RT-qPCR multiplex a été réalisé sur la base des tests WHO-Charité et U.S. CDC(13,14), avec le gène humain RNAse-P comme échantillon et contrôle d'extraction en suivant les détails du protocole décrit par Ferrer et al.(15). Pour le multiplex RT-qPCR, deux répétitions par échantillon d'ARN extrait ont été réalisées. Les résultats ont été normalisés en copies de virus par ml de salive.

Pour la culture du SRAS-CoV-2 à partir d'échantillons de salive dans des cellules Vero-E6, des cellules Vero-E6 (ATCC) ont été cultivées dans du DMEM supplémenté (Biowest) en suivant les détails du protocole décrit par Sánchez Barrueco et al.(15).

Des échantillons de salive dilués 1:1 dans du PBS 1X Dulbecco (Gibco) ont été centrifugés (5 minutes à 12 000 g) et 300 uL du surnageant ont été incubés en double avec 1,5x105 cellules Vero-E6 dans une plaque 24 puits (Corning) pendant une heure à 37°C pour permettre l'absorption des virus vivants. Ensuite, la salive (avec les virus non absorbés) a été retirée et remplacée par 500 ul de milieu d'infection (supplémenté de DMEM avec de la trypsine TPCK 6 ug/ml (Biowest)) et incubée pendant 5 jours à 37°C et 5 % de CO2. Après 5 jours d'infection, les deux surnageants ont été collectés pour l'extraction de l'ARN en suivant les instructions de la plate-forme eMAG et l'effet cytopathique (CPE) a été enregistré comme négatif ou positif (14). Le CPE était évident dans les cellules témoins positives ensemencées avec 300 uL de virus stock SARS-CoV-2 (souche MAD-6, 1,33 TCID50/mL, CNB-CSIC, Espagne) -, absentes dans les cellules témoins négatives ensemencées avec 300 uL de PBS- et variable dans les cellules ensemencées avec des échantillons de salive, en fonction de la charge virale dans la salive. Une culture a été considérée comme positive lorsque la valeur Ct RT-qPCR dans le surnageant de culture au jour 5 était < 37 (équivalent à ≥ 2x103 copies/mL de SARS-CoV-2).

Concernant les analyses à réaliser, l'objectif principal de l'étude est de déterminer l'effet des différents bains de bouche sur la charge virale SARS-Cov2 dans la salive testée in vivo. Ainsi, le résultat principal sera le changement de la viabilité de la charge virale salivaire entre la ligne de base et les trois points temporels post-rince-bouche dans chaque traitement. De plus, les corrélations entre la charge virale basale et la viabilité avant rinçage avec les différentes données cliniques recueillies, telles que l'âge, le sexe, les jours depuis l'apparition des symptômes et les jours depuis la positivité virale des patients déterminée par PCR de prélèvements nasopharyngés, seront également être étudiée. Enfin, les associations possibles entre les variables cliniques catégorielles et la fréquence des patients dont la charge virale et la viabilité s'améliorent à différents moments pour les différents traitements seront évaluées.

En supposant que l'échantillon de salive de base est considéré comme un contrôle pour chaque patient, les enquêteurs ont envisagé d'atteindre 5 patients par bras (CHX 0,12 %, CHX 0,2 %, Cym ZnCl2 et placebo) pour identifier des différences significatives entre les groupes de plus de 20 %. Avec un alpha de Cronbach de 0,05, une puissance de 0,8 et un taux d'abandon possible de 10 % en raison d'un abandon ou d'une charge virale insuffisante, une taille d'échantillon minimale de 22 patients a été calculée.

Le test de Wilcoxon a été utilisé pour évaluer les différences moyennes entre les points temporels de l'étude (au départ et après 5, 15 et 60 minutes) et entre différents bains de bouche ou bras d'étude. Les analyses de corrélation de Spearman ont été effectuées pour évaluer la relation entre les variables cliniques et la charge virale salivaire de base, la charge viable ou la charge virale nasopharyngée. Tous les calculs et tests ont été effectués avec le logiciel R (version 3.6.3, paquet "statistiques")