Evaluering av effektiviteten av munnskylling med kommersielle munnvann for å redusere viral mengde i spytt hos COVID-19-pasienter

Strategier som reduserer spyttvirusmengden kan bidra til å redusere risikoen for overføring av SARS-CoV-2. Dermed kan bruk av munnvann med antiseptika som har virucidal aktivitet være en enkel og rimelig forebyggende strategi som lett kan brukes i befolkningen generelt. For å evaluere effekten av flere antiseptika for å nøytralisere eller redusere SARS-CoV-2-virusmengden in vivo i spyttprøver, er det utviklet en multisenter, randomisert, blind, fire-parallell-gruppe, placebokontrollert studie.

Studien vil bli utført i Madrid, på tre forskjellige sykehus: Fundación Jiménez Díaz universitetssykehus (Madrid, Spania), Villalba universitetssykehus (Madrid, Spania) og Infanta Elena universitetssykehus (Madrid, Spania).

Hver pasient inkludert er tidligere diagnostisert og innlagt på sykehus på grunn av SARS-COV-2-infeksjon, og blir hovedsakelig innlagt for respiratorisk patologi. Alle vil være voksne (alder >18 år) og gi sitt frivillige skriftlige eller muntlige samtykke til deltakelse i henhold til anbefalinger fra sykehusets etiske komité.

Etter godkjenning av samtykke vil sykehuspersonalet som er ansvarlig for intervensjonene fortløpende tildele hver deltaker en kode etter ordre fra en tidligere tilfeldig generert tabell. Koden vil bestå av et pasientnummer og en bokstav som tilsvarer en av de fire studiegruppene (A, B, C og D), som vil være kjent for det kliniske personalet, men ukjent for laboratoriepersonellet som skal behandle prøver og trekke ut RNA , så vel som til de som skal analysere dataene. På denne måten vil deltakerne bli tilfeldig fordelt i en av de fire behandlingsgruppene og blinde oppnås ved å bruke identiske rør med samme volum for både munnvann og placebo.

Hver inkludert pasient blir bedt om å ikke spise, drikke annet enn vann, tygge tyggegummi, røyke, pusse tenner eller bruke munnvann i én time før prøvetaking. I tillegg får de ikke drikke på en halvtime etter munnvannet og spise hele testen.

Fire munnvann er randomisert: skyllinger er klare til bruk i deres kommersielle formler. Alle munnvann er kommersielle produkter klassifisert som trygge.

Totalt 4 ikke-stimulerte spyttprøver vil bli samlet inn for hver pasient: en basal og tre etter munnskyllevannet, henholdsvis 5 minutter, 15 minutter og 60 minutter. Hver deltaker ble bedt om å donere fire spyttprøver på minst 2 ml: én ved baseline før skylling, og tre andre ved 5, 15 og 60 minutter etter munnvann. Hver prøve gitt av pasienten ble samlet ved å bruke siklingteknikken, og kasserte sekreter oppnådd etter ekspektorasjon i et sterilt millimeter plastrør. Etter innsamling av baseline spyttprøven (forskylling, t0), skyllet hver pasient med det randomiserte munnvannet (15 ml) i ett minutt. Pasienten ble bedt om å sørge for at munnvannet nådde alle tenner, tannkjøtt, gane og tunge, uten å svelge eller gurgle. Ved henholdsvis 5 minutter (t5'), 15 minutter (t15') og 60 minutter (t60') etter skylling, ble det samlet inn minst 2 ml spytt per prøve. Når de nødvendige 2 ml spyttprøve var nådd, ble plastrøret merket med koden tildelt pasienten og tidspunktet, og holdt hermetisk forseglet ved -80ºC. Alle prøvene ble overført til Biosafety Level 3 (BSL-3) laboratoriet (FISABIO-Public Health) på tørris i henhold til UN3733-standarder.

I BSL-3-laboratoriet ved FISABIO-Public Health ble prøvene tint ved romtemperatur og en 200 ul aliquot av hver ble brukt til RNA-ekstraksjon. Det gjenværende volumet av hver prøve ble umiddelbart lagret ved -80C inntil videre testing i Vero-E6-cellelinjer. For RNA-ekstraksjon ble lysering for det første utført med proteinase K (Episenter) i 20 minutter ved 56 °C etterfulgt av den helautomatiserte eMAG-plattformen (bioMérieux, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner for spyttprøver. Deretter, for å påvise SARS-CoV-2 E-genet, ble det utført en multipleks RT-qPCR-test basert på WHO-Charité og U.S. CDC-analyser(13,14), sammen med det humane RNAse-P-genet som prøve- og ekstraksjonskontroll etter detaljene i protokollen beskrevet av Ferrer et al.(15). For multipleks RT-qPCR ble to replikater per prøve av ekstrahert RNA utført. Resultatene ble normalisert til viruskopier per ml spytt.

For SARS-CoV-2-kultur fra spyttprøver i Vero-E6-celler, ble Vero-E6-celler (ATCC) dyrket i supplert DMEM (Biowest) etter detaljene i protokollen beskrevet av Sánchez Barrueco et al.(15).

Spyttprøver fortynnet 1:1 i 1X Dulbeccos PBS (Gibco) ble sentrifugert (5 minutter ved 12 000 g) og 300 ul av supernatanten ble inkubert i duplikat med 1,5x105 Vero-E6-celler i en 24-brønns plate (Corning) for én time ved 37°C for å tillate absorpsjon av levende virus. Deretter ble spytt (med uabsorberte virus) fjernet og erstattet med 500 uL infeksjonsmedier (supplert DMEM med trypsin TPCK 6 ug/ml (Biowest)) og inkubert i 5 dager ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 5 dager med infeksjon ble begge supernatantene samlet for RNA-ekstraksjon etter eMAG-plattformens instruksjoner og cytopatisk effekt (CPE) ble registrert som negativ eller positiv (14). CPE var tydelig i positive kontrollceller sådd med 300 uL SARS-CoV-2 stamvirus (MAD-6-stamme, 1,33 TCID50/mL, CNB-CSIC, Spania)-, fraværende i negative kontroller-celler sådd med 300 uL PBS- og variabel i cellene sådd med spyttprøver, avhengig av virusmengden i spytt. En kultur ble ansett som positiv når RT-qPCR Ct-verdien i dag 5 kultursupernatant var < 37 (tilsvarer ≥ 2x103 SARS-CoV-2 kopier/ml).

Når det gjelder analysene som skal utføres, er hovedmålet med studien å bestemme effekten av de forskjellige munnvannene på SARS-Cov2 virusmengden i spytt testet in vivo. Dermed vil det primære resultatet være endringen i spyttvirusbelastningens levedyktighet mellom baseline og de tre post-munnskylletidspunktene i hver behandling. I tillegg vil korrelasjonene mellom den basale virusmengden og levedyktigheten før skylling med de forskjellige kliniske dataene som er samlet inn, som alder, kjønn, dager siden opptreden av symptomer og dager siden pasientenes viruspositivitet bestemt ved PCR av nasofaryngeale prøver også bli studert. Til slutt vil de mulige assosiasjonene mellom kategoriske kliniske variabler og frekvensen av pasienter som forbedrer seg i virusmengde og levedyktighet til ulike tidspunkter for de ulike behandlingene bli evaluert.

Forutsatt at baseline spyttprøven anses som en kontroll for hver pasient, vurderte etterforskerne å nå 5 pasienter per arm (CHX 0,12 %, CHX 0,2 %, Cym ZnCl2 og placebo) for å identifisere signifikante forskjeller mellom grupper på mer enn 20 %. Med en Cronbachs alfa på 0,05, kraft på 0,8 og en mulig frafallsrate på 10 % på grunn av frafall eller utilstrekkelig virusmengde, ble det beregnet en minste prøvestørrelse på 22 pasienter.

Wilcoxon-testen ble brukt til å vurdere gjennomsnittlige forskjeller mellom studietidspunkter (baseline og etter 5, 15 og 60 minutter) og mellom forskjellige munnvann eller studiearmer. Spearmans korrelasjonsanalyser ble utført for å vurdere sammenhengen mellom kliniske variabler med spyttvirusbelastning ved baseline, levedyktig belastning eller nasofaryngeal viral belastning. Alle beregninger og tester ble utført med R-programvare (versjon 3.6.3, "statistikk"-pakke)