Utvärdering av effektiviteten av munsköljningar med kommersiella munvatten för att minska virusmängden i saliv hos covid-19-patienter

Strategier som minskar salivvirusbelastningen kan bidra till att minska risken för överföring av SARS-CoV-2. Således kan användningen av munvatten med antiseptika som har virusdödande aktivitet vara en enkel och billig förebyggande strategi som lätt skulle kunna tillämpas i den allmänna befolkningen. För att utvärdera effekten av flera antiseptika för att neutralisera eller minska SARS-CoV-2 virusmängden in vivo i salivprover, har en multicenter, randomiserad, blind, placebokontrollerad prövning med fyra parallella grupper utformats.

Studien kommer att utföras i Madrid, på tre olika sjukhus: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spanien), Villalba University General Hospital (Madrid, Spanien) och Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spanien).

Varje patient som ingår har tidigare diagnostiserats och lagts in på sjukhus på grund av SARS-COV-2-infektion, och tas in huvudsakligen för respiratorisk patologi. Alla kommer att vara vuxna (ålder >18 år) och ge sitt frivilliga skriftliga eller muntliga samtycke till deltagande enligt sjukhusets etiska kommittés rekommendationer.

Efter godkännande av samtycke kommer sjukhuspersonalen som är ansvarig för interventionerna i följd att tilldela varje deltagare en kod enligt ordern från en tidigare slumpmässigt genererad tabell. Koden kommer att bestå av ett patientnummer och en bokstav som motsvarar en av de fyra studiegrupperna (A, B, C och D), som kommer att vara känd för den kliniska personalen men okända för laboratoriepersonalen som ska behandla prover och extrahera RNA , såväl som till de som kommer att analysera data. På detta sätt kommer deltagarna att slumpmässigt tilldelas en av de fyra behandlingsgrupperna och blinda kommer att uppnås genom att använda identiska rör med samma volym för både munvatten och placebo.

Varje inkluderad patient uppmanas att inte äta, dricka annat än vatten, tugga tuggummi, röka, borsta tänderna eller använda munvatten i en timme före provtagning. Dessutom får de inte dricka på en halvtimme efter munsköljningen och äta under hela provet.

Fyra munvatten är randomiserade: sköljningar är redo att användas i sina kommersiella formler. Alla munvatten är kommersiella produkter som klassificeras som säkra.

Totalt 4 icke-stimulerade salivprover kommer att samlas in för varje patient: en basal och tre efter munsköljningen, efter 5 minuter, efter 15 minuter respektive efter 60 minuter. Varje deltagare ombads donera fyra salivprover på minst 2 ml: ett vid baslinjen före sköljning och tre andra vid 5, 15 och 60 minuter efter munvatten. Varje prov som patienten tillhandahållit samlades in med hjälp av dreglingstekniken, varvid sekret som erhållits efter UPPHOSTNING kasserades i ett sterilt millimeter plaströr. Efter att ha samlat in baslinjens salivprov (försköljning, t0), sköljde varje patient med det randomiserade munvatten (15 ml) i en minut. Patienten instruerades att se till att munvatten nådde alla tänder, tandkött, gom och tunga, utan att svälja eller gurgla. Vid 5 minuter (t5'), 15 minuter (t15') respektive 60 minuter (t60') efter sköljning, uppsamlades minst 2 ml saliv per prov. När de erforderliga 2 ml salivprov hade uppnåtts märktes plaströret med koden som tilldelats patienten och tidpunkten och hölls hermetiskt förseglad vid -80ºC. Alla prover överfördes till Biosafety Level 3 (BSL-3) laboratoriet (FISABIO-Public Health) på torris enligt UN3733-standarder.

I BSL-3-laboratoriet vid FISABIO-Public Health tinades proverna vid rumstemperatur och en 200 ul alikvot av varje användes för RNA-extraktion. Den återstående volymen av varje prov lagrades omedelbart vid -80C tills ytterligare testning i Vero-E6-cellinjer. För RNA-extraktion utfördes först lysering med proteinas K (Epicentre) i 20 minuter vid 56°C följt av den helt automatiserade eMAG-plattformen (bioMérieux, Frankrike) enligt tillverkarens instruktioner för salivprover. Sedan, för att detektera SARS-CoV-2 E-genen, utfördes ett multiplex RT-qPCR-test baserat på WHO-Charité och U.S.A. CDC-analyser(13,14), tillsammans med den humana RNAse-P-genen som prov och extraktionskontroll efter detaljerna i protokollet som beskrivs av Ferrer et al.(15). För multiplex RT-qPCR utfördes två replikat per prov av extraherat RNA. Resultaten normaliserades till viruskopior per ml saliv.

För SARS-CoV-2-odling från salivprover i Vero-E6-celler odlades Vero-E6-celler (ATCC) i kompletterat DMEM (Biowest) enligt detaljerna i protokollet som beskrivs av Sánchez Barrueco et al.(15).

Salivprover spädda 1:1 i 1X Dulbeccos PBS (Gibco) centrifugerades (5 minuter vid 12 000 g) och 300 ul av supernatanten inkuberades i duplikat med 1,5x105 Vero-E6-celler i en 24-brunnars platta (Corning) för en timme vid 37°C för att möjliggöra absorption av levande virus. Sedan avlägsnades saliv (med oabsorberade virus) och ersattes med 500 ul infektionsmedium (kompletterat DMEM med trypsin TPCK 6 ug/ml (Biowest)) och inkuberades i 5 dagar vid 37°C och 5% CO2. Efter 5 dagars infektion samlades båda supernatanterna för RNA-extraktion enligt eMAG-plattformens instruktioner och cytopatisk effekt (CPE) registrerades som negativ eller positiv (14). CPE var uppenbart i positiva kontrollceller sådda med 300 uL SARS-CoV-2 stamvirus (MAD-6-stam, 1,33 TCID50/ml, CNB-CSIC, Spanien)-, frånvarande i negativa kontroller-celler ympade med 300 uL PBS- och varierande i celler som såddes med salivprover, beroende på virusmängden i saliv. En kultur ansågs positiv när RT-qPCR Ct-värdet i dag 5 kultursupernatanten var < 37 (motsvarande ≥ 2x103 SARS-CoV-2 kopior/ml).

När det gäller de analyser som ska utföras, är huvudsyftet med studien att fastställa effekten av de olika munsköljningarna på SARS-Cov2-virusmängden i saliv som testats in vivo. Sålunda kommer det primära resultatet att vara förändringen i salivvirusbelastningens livsduglighet mellan baslinjen och de tre tidpunkterna efter munsköljning i varje behandling. Dessutom kommer korrelationerna mellan den basala virusmängden och livsdugligheten före sköljning med de olika kliniska data som samlats in, såsom ålder, kön, dagar efter uppkomsten av symtom och dagar sedan patienternas viruspositivitet bestämd med PCR av nasofaryngeala prover också studeras. Slutligen kommer de möjliga sambanden mellan kategoriska kliniska variabler och frekvensen av patienter som förbättras i virusmängd och livsduglighet vid olika tidpunkter för de olika behandlingarna att utvärderas.

Om man antar att salivprovet vid baslinjen betraktas som en kontroll för varje patient, övervägde utredarna att nå 5 patienter per arm (CHX 0,12 %, CHX 0,2 %, Cym ZnCl2 och placebo) för att identifiera signifikanta skillnader mellan grupper på mer än 20 %. Med en Cronbachs alfa på 0,05, en styrka på 0,8 och en 10% möjlig bortfallsfrekvens på grund av bortfall eller otillräcklig virusmängd, beräknades en minsta provstorlek på 22 patienter.

Wilcoxon-testet användes för att bedöma medelskillnader mellan studietidpunkter (baslinje och efter 5, 15 och 60 minuter) och mellan olika munvatten eller studiearmar. Spearmans korrelationsanalyser utfördes för att bedöma sambandet mellan kliniska variabler med salivviral belastning, livskraftig belastning eller nasofarynx viral belastning. Alla beräkningar och tester utfördes med R-programvara (version 3.6.3, "stats"-paket)