评估使用商业漱口水漱口水降低 COVID-19 患者唾液病毒载量的功效

减少唾液病毒载量的策略可能有助于降低 SARS-CoV-2 传播的风险。 因此，使用含有具有杀病毒活性的防腐剂的漱口水可能是一种简单且成本低廉的预防策略，可以很容易地应用于一般人群。 为了评估几种防腐剂在体内中和或减少唾液样本中 SARS-CoV-2 病毒载量的效果，设计了一项多中心、随机、盲法、四平行组、安慰剂对照试验。

该研究将在马德里的三所不同医院进行：Fundación Jiménez Díaz 大学医院（西班牙马德里）、Villalba 大学总医院（西班牙马德里）和 Infanta Elena 大学医院（西班牙马德里）。

包括的每一位患者之前都因 SARS-COV-2 感染而被诊断和住院，主要因呼吸道病理学入院。 他们都是成年人（年龄 >18 岁），并根据医院伦理委员会的建议提供自愿的书面或口头参与同意书。

在同意同意后，负责干预的医院工作人员将按照先前随机生成的表格中的顺序连续为每个参与者分配一个代码。 该代码将包含一个患者编号和一个与四个研究组（A、B、C 和 D）之一相对应的字母，临床人员知道这些代码，但处理样本和提取 RNA 的实验室人员不知道，以及那些将分析数据的人。 通过这种方式，参与者将被随机分配到四个治疗组之一，并且将通过使用相同容量的相同试管来盛装漱口水和安慰剂来实现盲目化。

每位纳入的患者都被要求在样本采集前一小时内禁食、禁水、饮水、嚼口香糖、抽烟、刷牙或使用任何漱口水。 此外，漱口后半小时内不得饮水，整个测试期间不得进食。

四种漱口水是随机的：漱口水已准备好用于其商业配方。 所有漱口水都是被归类为安全的商业产品。

将为每位患者收集总共 4 个未刺激的唾液样本：分别在 5 分钟、15 分钟和 60 分钟时收集 1 个基础唾液样本和 3 个漱口后唾液样本。 每个参与者都被要求捐出至少 2 毫升的四个唾液样本：一个在基线时冲洗前，另外三个在漱口后 5、15 和 60 分钟。 使用流口水技术收集患者提供的每个样本，将咳出后获得的分泌物丢弃在无菌毫米塑料管中。 收集基线唾液样本（预冲洗，t0）后，每位患者用随机漱口水 (15 mL) 冲洗一分钟。 指示患者确保漱口水到达所有牙齿、牙龈、上颚和舌头，而无需吞咽或漱口。 在漂洗后分别在 5 分钟（t5'）、15 分钟（t15'）和 60 分钟（t60'）时，每个样品至少收集 2 mL 唾液。 一旦达到所需的 2 mL 唾液样本，塑料管就会贴上分配给患者的代码和时间点，并在 -80ºC 下密封保存。 根据 UN3733 标准，所有样品都在干冰上转移到生物安全 3 级 (BSL-3) 实验室 (FISABIO-Public Health)。

在 FISABIO-Public Health 的 BSL-3 实验室中，样品在室温下解冻，每个样品的 200 uL 等分试样用于 RNA 提取。 每个样品的剩余体积立即储存在-80°C，直到在 Vero-E6 细胞系中进一步测试。 对于 RNA 提取，首先，根据唾液样本制造商的说明，使用蛋白酶 K (Epicentre) 在 56°C 下裂解 20 分钟，然后使用全自动 eMAG 平台（bioMérieux，法国）进行裂解。 然后，为了检测 SARS-CoV-2 E 基因，基于 WHO-Charité 和美国 CDC 检测 (13,14) 进行了多重 RT-qPCR 测试，同时以人 RNAse-P 基因作为样本和提取对照遵循 Ferrer 等人 (15) 描述的协议的详细信息。 对于多重 RT-qPCR，每个提取的 RNA 样本进行两次重复。 结果标准化为每毫升唾液的病毒拷贝数。

对于 Vero-E6 细胞唾液样本中的 SARS-CoV-2 培养物，Vero-E6 细胞 (ATCC) 在补充的 DMEM (Biowest) 中培养，具体遵循 Sánchez Barrueco 等人 (15) 描述的方案细节。

将在 1X Dulbecco's PBS (Gibco) 中按 1:1 稀释的唾液样品离心（12,000 g 5 分钟），并将 300 uL 上清液与 1.5x105 Vero-E6 细胞一式两份在 24 孔板（Corning）中孵育 1 次在 37°C 下放置 1 小时以吸收活病毒。 然后，去除唾液（带有未吸收的病毒）并用 500 uL 感染培养基（补充有胰蛋白酶 TPCK 6ug/ml (Biowest) 的 DMEM）代替，并在 37°C 和 5% CO2 下孵育 5 天。 感染 5 天后，按照 eMAG 平台说明收集两种上清液用于 RNA 提取，并将细胞病变效应 (CPE) 记录为阴性或阳性 (14)。 CPE 在阳性对照中很明显——细胞接种了 300 uL SARS-CoV-2 原种病毒（MAD-6 株，1.33 TCID50/mL，CNB-CSIC，西班牙）——在阴性对照中不存在——细胞接种了 300 uL PBS-并且根据唾液中的病毒载量，用唾液样本接种的细胞会发生变化。 当第 5 天培养上清液中的 RT-qPCR Ct 值 < 37（相当于 ≥ 2x103 SARS-CoV-2 拷贝/mL）时，培养被认为是阳性的。

关于要进行的分析，该研究的主要目的是确定不同漱口水对体内测试的唾液中 SARS-Cov2 病毒载量的影响。 因此，主要结果将是每次治疗中基线和三个漱口后时间点之间唾液病毒载量活力的变化。 此外，基础病毒载量和冲洗前存活率与收集的不同临床数据（例如年龄、性别、出现症状后的天数和通过鼻咽样本 PCR 确定患者病毒阳性后的天数）之间的相关性也将被研究。 最后，将评估分类临床变量与在不同时间针对不同治疗提高病毒载量和生存力的患者频率之间的可能关联。

假设基线唾液样本被视为每位患者的对照，研究人员考虑每组达到 5 名患者（CHX 0.12%、CHX 0.2%、Cym ZnCl2 和安慰剂）以确定组间超过 20% 的显着差异。 克朗巴赫的 alpha 为 0.05，功效为 0.8，并且由于退出或病毒载量不足导致的 10% 可能退出率，计算了 22 名患者的最小样本量。

Wilcoxon 检验用于评估研究时间点（基线和 5、15 和 60 分钟后）之间以及不同漱口水或研究组之间的平均差异。 执行 Spearman 相关性分析以评估临床变量与基线唾液病毒载量、活载量或鼻咽病毒载量之间的关系。 所有计算和测试均使用 R 软件（版本 3.6.3， “统计”包）