Avaliação da eficácia de enxaguatórios bucais com enxaguatórios bucais comerciais para diminuir a carga viral na saliva em pacientes com COVID-19

Estratégias de redução da carga viral salivar podem contribuir para reduzir o risco de transmissão do SARS-CoV-2. Assim, o uso de bochechos com antissépticos com atividade virucida pode ser uma estratégia preventiva simples e de baixo custo, podendo ser facilmente aplicada na população em geral. Para avaliar o efeito de vários antissépticos para neutralizar ou reduzir a carga viral de SARS-CoV-2 in vivo em amostras de saliva, foi desenvolvido um estudo multicêntrico, randomizado, cego, com quatro grupos paralelos e controlado por placebo.

O estudo será realizado em Madri, em três hospitais diferentes: Hospital Universitário Fundación Jiménez Díaz (Madrid, Espanha), Hospital Geral Universitário Villalba (Madrid, Espanha) e Hospital Universitário Infanta Elena (Madrid, Espanha).

Todos os pacientes incluídos são previamente diagnosticados e internados por infecção por SARS-COV-2, sendo internados principalmente por patologia respiratória. Todos eles serão adultos (idade > 18 anos) e fornecerão seu consentimento voluntário por escrito ou oral para participação de acordo com as recomendações do comitê de ética do hospital.

Após a aprovação do consentimento, a equipe do hospital responsável pelas intervenções atribuirá consecutivamente a cada participante um código seguindo a ordem de uma tabela previamente gerada aleatoriamente. O código consistirá em um número de paciente e uma letra correspondente a um dos quatro grupos de estudo (A, B, C e D), que serão conhecidos pelo pessoal clínico, mas desconhecidos pelo pessoal do laboratório que irá processar as amostras e extrair o RNA , bem como àqueles que irão analisar os dados. Dessa forma, os participantes serão aleatoriamente designados para um dos quatro grupos de tratamento e o cego será alcançado usando tubos idênticos com o mesmo volume para enxaguatórios bucais e placebo.

Todos os pacientes incluídos são orientados a não comer, beber nada além de água, mascar chiclete, fumar, escovar os dentes ou usar qualquer enxaguante bucal por uma hora antes da coleta da amostra. Além disso, eles não podem beber por meia hora após o bochecho e comer durante todo o teste.

Quatro enxaguatórios bucais são randomizados: os enxaguatórios estão prontos para uso em suas fórmulas comerciais. Todos os enxaguatórios bucais são produtos comerciais classificados como seguros.

Um total de 4 amostras de saliva não estimulada serão coletadas para cada paciente: uma basal e três após o bochecho, aos 5 minutos, aos 15 minutos e aos 60 minutos, respectivamente. Cada participante foi solicitado a doar quatro amostras de saliva de pelo menos 2 mL: uma antes do bochecho e outras três aos 5, 15 e 60 minutos após o bochecho. Cada amostra fornecida pelo paciente foi coletada pela técnica de salivação, descartando-se as secreções obtidas após a expectoração em tubo plástico milimetrado estéril. Após a coleta da amostra basal de saliva (pré-enxágue, t0), cada paciente enxaguou com o enxaguatório bucal randomizado (15 mL) por um minuto. O paciente foi instruído a garantir que o enxaguatório atingisse todos os dentes, gengiva, palato e língua, sem engolir ou gargarejar. Aos 5 minutos (t5'), 15 minutos (t15') e 60 minutos (t60') após o enxágue, respectivamente, foram coletados pelo menos 2 mL de saliva por amostra. Uma vez atingidos os 2 mL de amostra de saliva necessários, o tubo plástico foi etiquetado com o código atribuído ao paciente e o tempo, e mantido hermeticamente fechado a -80ºC. Todas as amostras foram transferidas para o laboratório de Nível de Biossegurança 3 (BSL-3) (FISABIO-Public Health) em gelo seco de acordo com as normas UN3733.

No laboratório BSL-3 da FISABIO-Saúde Pública, as amostras foram descongeladas em temperatura ambiente e uma alíquota de 200 uL de cada uma foi utilizada para extração de RNA. O volume restante de cada amostra foi imediatamente armazenado a -80C até novos testes em linhagens de células Vero-E6. Para extração de RNA, primeiramente, a lise foi realizada com proteinase K (Epicentre) por 20 minutos a 56°C, seguida pela plataforma eMAG totalmente automatizada (bioMérieux, França) de acordo com as instruções do fabricante para amostras de saliva. Em seguida, para detectar o gene SARS-CoV-2 E, foi realizado um teste multiplex RT-qPCR com base nos ensaios WHO-Charité e U.S. CDC(13,14), juntamente com o gene humano RNAse-P como amostra e controle de extração seguindo os detalhes do protocolo descrito por Ferrer et al.(15). Para o multiplex RT-qPCR foram realizadas duas réplicas por amostra de RNA extraído. Os resultados foram normalizados para cópias de vírus por mL de saliva.

Para cultura de SARS-CoV-2 de amostras de saliva em células Vero-E6, as células Vero-E6 (ATCC) foram cultivadas em DMEM suplementado (Biowest) seguindo os detalhes do protocolo descrito por Sánchez Barrueco et al.(15).

Amostras de saliva diluídas 1:1 em 1X Dulbecco's PBS (Gibco) foram centrifugadas (5 minutos a 12.000 g) e 300 uL do sobrenadante foram incubados em duplicata com 1,5x105 células Vero-E6 em uma placa de 24 poços (Corning) por um hora a 37°C para permitir a absorção de vírus vivos. Em seguida, a saliva (com vírus não absorvidos) foi removida e substituída por 500 uL de meio de infecção (DMEM suplementado com tripsina TPCK 6ug/ml (Biowest)) e incubado por 5 dias a 37°C e 5% de CO2. Após 5 dias de infecção, ambos os sobrenadantes foram coletados para extração de RNA seguindo as instruções da plataforma eMAG e o efeito citopático (CPE) foi registrado como negativo ou positivo(14). CPE foi evidente em células-controle positivas semeadas com 300 uL do vírus estoque SARS-CoV-2 (estirpe MAD-6, 1,33 TCID50/mL, CNB-CSIC, Espanha)-, ausente em células-controle negativas semeadas com 300 uL de PBS- e variável nas células semeadas com amostras de saliva, dependendo da carga viral na saliva. Uma cultura foi considerada positiva quando o valor de RT-qPCR Ct no sobrenadante da cultura do dia 5 foi < 37 (equivalente a ≥ 2x103 cópias/mL de SARS-CoV-2).

Em relação às análises a serem realizadas, o principal objetivo do estudo é determinar o efeito dos diferentes colutórios na carga viral SARS-Cov2 na saliva testada in vivo. Assim, o resultado primário será a mudança na viabilidade da carga viral salivar entre a linha de base e os três momentos pós-bochechos em cada tratamento. Além disso, as correlações entre a carga viral basal e a viabilidade antes do bochecho com os diferentes dados clínicos coletados, como idade, sexo, dias desde o início dos sintomas e dias desde a positividade do vírus dos pacientes determinada por PCR de amostras nasofaríngeas também serão ser estudado. Finalmente, serão avaliadas as possíveis associações entre variáveis ​​clínicas categóricas e a frequência de pacientes que melhoram na carga viral e viabilidade em diferentes momentos para os diferentes tratamentos.

Assumindo que a amostra basal de saliva é considerada um controle para cada paciente, os investigadores consideraram atingir 5 pacientes por braço (CHX 0,12%, CHX 0,2%, Cym ZnCl2 e placebo) para identificar diferenças significativas entre os grupos de mais de 20%. Com alfa de Cronbach de 0,05, poder de 0,8 e taxa de abandono possível de 10% devido a abandono ou carga viral insuficiente, foi calculado um tamanho mínimo de amostra de 22 pacientes.

O teste de Wilcoxon foi usado para avaliar as diferenças médias entre os pontos de tempo do estudo (basal e após 5, 15 e 60 minutos) e entre diferentes bochechos ou braços de estudo. A análise de correlação de Spearman foi realizada para avaliar a relação entre as variáveis ​​clínicas com a carga viral salivar basal, carga viável ou carga viral nasofaríngea. Todos os cálculos e testes foram realizados com o software R (versão 3.6.3, pacote "estatísticas")