Valutazione dell'efficacia dei collutori con collutori commerciali per ridurre la carica virale nella saliva nei pazienti con COVID-19

Strategie di riduzione della carica virale salivare potrebbero contribuire a ridurre il rischio di trasmissione di SARS-CoV-2. Pertanto, l'uso di collutori con antisettici che hanno attività virucida può essere una strategia preventiva semplice ea basso costo che potrebbe essere facilmente applicata nella popolazione generale. Per valutare l'effetto di diversi antisettici per neutralizzare o ridurre la carica virale SARS-CoV-2 in vivo nei campioni di saliva, è stato progettato uno studio multicentrico, randomizzato, cieco, a quattro gruppi paralleli, controllato con placebo.

Lo studio sarà condotto a Madrid, in tre diversi ospedali: Fundación Jiménez Díaz University Hospital (Madrid, Spagna), Villalba University General Hospital (Madrid, Spagna) e Infanta Elena University Hospital (Madrid, Spagna).

Ogni paziente incluso viene preventivamente diagnosticato e ricoverato per infezione da SARS-COV-2, essendo ricoverato principalmente per patologia respiratoria. Tutti loro saranno adulti (età >18 anni) e forniranno il loro consenso volontario scritto o orale alla partecipazione secondo le raccomandazioni del comitato etico dell'ospedale.

Dopo l'approvazione del consenso, il personale ospedaliero responsabile degli interventi assegnerà consecutivamente a ciascun partecipante un codice seguendo l'ordine da una tabella precedentemente generata in modo casuale. Il codice sarà composto da un numero di paziente e da una lettera corrispondente a uno dei quattro gruppi di studio (A, B, C e D), che sarà noto al personale clinico ma sconosciuto al personale di laboratorio che processerà i campioni ed estrarrà l'RNA , nonché a coloro che analizzeranno i dati. In questo modo, i partecipanti verranno assegnati in modo casuale a uno dei quattro gruppi di trattamento e il cieco verrà raggiunto utilizzando provette identiche con lo stesso volume sia per i collutori che per il placebo.

A ogni paziente incluso viene chiesto di non mangiare, bere altro che acqua, masticare gomme, fumare, lavarsi i denti o usare collutori per un'ora prima della raccolta del campione. Inoltre, non possono bere per mezz'ora dopo il collutorio e mangiare per l'intero test.

Quattro collutori sono randomizzati: i risciacqui sono pronti per l'uso nelle loro formule commerciali. Tutti i collutori sono prodotti commerciali classificati come sicuri.

Verranno raccolti un totale di 4 campioni di saliva non stimolata per ogni paziente: uno basale e tre dopo il collutorio, rispettivamente a 5 minuti, a 15 minuti ea 60 minuti. Ad ogni partecipante è stato chiesto di donare quattro campioni di saliva di almeno 2 ml: uno al basale prima del risciacquo e altri tre a 5, 15 e 60 minuti dopo il collutorio. Ogni campione fornito dal paziente è stato raccolto utilizzando la tecnica della sbavatura, scartando le secrezioni ottenute dopo l'espettorazione in un tubo di plastica millimetrato sterile. Dopo aver raccolto il campione di saliva basale (pre-risciacquo, t0), ogni paziente ha risciacquato con il collutorio randomizzato (15 ml) per un minuto. Il paziente è stato istruito affinché il collutorio raggiungesse tutti i denti, le gengive, il palato e la lingua, senza deglutire o fare gargarismi. A 5 minuti (t5'), 15 minuti (t15') e 60 minuti (t60') dopo il risciacquo, rispettivamente, sono stati raccolti almeno 2 mL di saliva per campione. Una volta raggiunti i 2 mL di campione di saliva richiesti, il tubo di plastica è stato etichettato con il codice assegnato al paziente e il punto temporale e mantenuto ermeticamente sigillato a -80ºC. Tutti i campioni sono stati trasferiti al laboratorio di Biosafety Level 3 (BSL-3) (FISABIO-Public Health) su ghiaccio secco secondo gli standard UN3733.

Nel laboratorio BSL-3 presso FISABIO-Public Health, i campioni sono stati scongelati a temperatura ambiente e un'aliquota di 200 uL di ciascuno è stata utilizzata per l'estrazione dell'RNA. Il volume rimanente di ciascun campione è stato immediatamente conservato a -80°C fino a ulteriori test nelle linee cellulari Vero-E6. Per l'estrazione dell'RNA, in primo luogo, è stata eseguita la lisi con proteinasi K (epicentro) per 20 minuti a 56°C, seguita dalla piattaforma eMAG completamente automatizzata (bioMérieux, Francia) secondo le istruzioni del produttore per i campioni di saliva. Quindi, per rilevare il gene SARS-CoV-2 E, è stato eseguito un test multiplex RT-qPCR basato sui test WHO-Charité e US CDC(13,14), insieme al gene umano RNAse-P come campione e controllo di estrazione seguendo i dettagli del protocollo descritto da Ferrer et al.(15). Per il multiplex RT-qPCR sono state eseguite due repliche per campione di RNA estratto. I risultati sono stati normalizzati in copie di virus per ml di saliva.

Per la coltura SARS-CoV-2 da campioni di saliva in cellule Vero-E6, le cellule Vero-E6 (ATCC) sono state coltivate in DMEM integrato (Biowest) seguendo i dettagli del protocollo descritto da Sánchez Barrueco et al.(15).

Campioni di saliva diluiti 1:1 in 1X Dulbecco's PBS (Gibco) sono stati centrifugati (5 minuti a 12.000 g) e 300 uL del supernatante sono stati incubati in duplicato con 1,5x105 cellule Vero-E6 in una piastra a 24 pozzetti (Corning) per uno ora a 37°C per consentire l'assorbimento di virus vivi. Quindi, la saliva (con virus non assorbiti) è stata rimossa e sostituita da 500 uL di terreno di infezione (integrato con DMEM con tripsina TPCK 6ug/ml (Biowest)) e incubato per 5 giorni a 37°C e 5% CO2. Dopo 5 giorni di infezione, entrambi i surnatanti sono stati raccolti per l'estrazione dell'RNA seguendo le istruzioni della piattaforma eMAG e l'effetto citopatico (CPE) è stato registrato come negativo o positivo(14). CPE era evidente nei controlli positivi-cellule seminate con 300 uL di virus stock SARS-CoV-2 (ceppo MAD-6, 1,33 TCID50/mL, CNB-CSIC, Spagna)-, assente nei controlli negativi-cellule seminate con 300 uL PBS- e variabile nelle cellule seminate con campioni di saliva, a seconda della carica virale nella saliva. Una coltura è stata considerata positiva quando il valore Ct di RT-qPCR nel surnatante di coltura del giorno 5 era < 37 (equivalente a ≥ 2x103 SARS-CoV-2 copie/mL).

Per quanto riguarda le analisi da eseguire, l'obiettivo principale dello studio è determinare l'effetto dei diversi collutori sulla carica virale SARS-Cov2 nella saliva testata in vivo. Pertanto, l'esito primario sarà il cambiamento della vitalità della carica virale salivare tra il basale e i tre punti temporali post-collutorio in ciascun trattamento. Verranno inoltre valutate le correlazioni tra carica virale basale e vitalità prima del risciacquo con i diversi dati clinici raccolti, quali età, sesso, giorni dalla comparsa dei sintomi e giorni dalla positività al virus dei pazienti determinata mediante PCR su campioni nasofaringei essere studiato. Infine, saranno valutate le possibili associazioni tra variabili cliniche categoriche e la frequenza di pazienti che migliorano in carica virale e vitalità in tempi diversi per i diversi trattamenti.

Supponendo che il campione di saliva al basale sia considerato un controllo per ciascun paziente, i ricercatori hanno preso in considerazione il raggiungimento di 5 pazienti per braccio (CHX 0,12%, CHX 0,2%, Cym ZnCl2 e placebo) per identificare differenze significative tra i gruppi superiori al 20%. Con un alfa di Cronbach di 0,05, una potenza di 0,8 e un tasso di abbandono possibile del 10% dovuto a abbandono o carica virale insufficiente, è stata calcolata una dimensione minima del campione di 22 pazienti.

Il test di Wilcoxon è stato utilizzato per valutare le differenze medie tra i punti temporali dello studio (basale e dopo 5, 15 e 60 minuti) e tra diversi collutori o bracci di studio. Le analisi di correlazione di Spearman sono state eseguite per valutare la relazione tra variabili cliniche con carica virale salivare al basale, carica vitale o carica virale nasofaringea. Tutti i calcoli e i test sono stati eseguiti con il software R (versione 3.6.3, pacchetto "statistiche")