5FU vs 5FU z preparatem wiskoelastycznym do zapobiegania powstawaniu blizn po trabekulektomii

Konkretne cele

Celem pracy jest określenie, czy igłowanie pęcherzyka spojówkowego po trabekulektomii z podspojówkowym wstrzyknięciem preparatu 5-fluorouracylu (5FU)/lepkosprężystego jest skuteczną metodą przedłużonego dostarczania leku w zapobieganiu pooperacyjnemu bliznowaceniu spojówki.

Projekt badania

Eksperymenty z kulturami komórkowymi

Przeprowadzono eksperymenty na hodowlach komórkowych w celu określenia wpływu kwasu hialuronowego, w różnych dostępnych na rynku stężeniach, na ludzkie fibroblasty Tenona, docelowy typ komórek proponowanej przez nas mieszaniny HA/5FU. Wykonujemy również testy w celu zbadania profili farmakokinetycznych uwalniania leków różnych preparatów 5FU/HA. To pozwoliło nam określić najskuteczniejszy preparat do stosowania u pacjentów w ramieniu klinicznym badania.

Pokrótce, ludzkie fibroblasty Tenona uzyskane z eksplantatów tkanek z oczu zwłok hodowano do konfluencji w płodowej surowicy cielęcej zawierającej standardowe antybiotyki do hodowli tkankowych, gentamycynę i amfoterycynę, i umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C przy wilgotności 95% z 5% CO2. Komórki pasażowano po konfluencji i stosowano do eksperymentów między pasażami 3-6.

Ekspresja aktyny alfa mięśni gładkich Fibroblasty Tenona wysiano na 24-studzienkowe płytki i inkubowano z płodową surowicą cielęcą (FCS) zawierającą standardowe antybiotyki do hodowli tkankowych, gentamycynę i amfoterycynę, i umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C przy wilgotności 95% z 5% CO2. Pożywkę hodowlaną usunięto po 24 godzinach i zastąpiono świeżą pożywką opisaną poniżej.

Wytwarzanie kolagenu I Standardowe 3-D żele kolagenu I zaszczepione fibroblastami do testów skurczu żelu zastosowano do ilościowego określenia wytwarzania kolagenu przez fibroblasty traktowane różnymi stężeniami HA. Żele potraktowane TGF beta (znanym stymulatorem syntezy kolagenu I i induktorem ekspresji aktyny alfa mięśni gładkich, tj. fenotypu miofibroblastów) stanowiły kontrolę pozytywną. Kolagen typu I pochodzący z ogona szczura zmieszano z pożywką hodowlaną i po konfluencji, trypsynizowane komórki ponownie zawieszono w tej mieszaninie i wylano na 24-studzienkową płytkę i pozostawiono do polimeryzacji w inkubatorze w temperaturze 37°C. Po polimeryzacji żele zostały delikatnie oddzielone od płytek, na których zostały odlane i zawieszone w świeżej pożywce opisanej poniżej

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach i powtórzono 3 razy.

Ludzkie fibroblasty Tenona hodowano w świeżej pożywce zawierającej sam HA, 5-FU/HA (stężenia HA 10, 14, 23 mg/ml) lub hodowano bez HA lub 5FU (kontrole). Reakcję zwłóknienia i bliznowacenia miofibroblastów oceniono na podstawie ekspresji kolagenu I i alfa aktyny mięśni gładkich (ASMA), które określono ilościowo za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Test WST-1 określał żywotność komórek. Roztwór lub proszek 5-FU zdyspergowano w HA i mieszano mechanicznie, a następnie mieszano na worteksie.

Nasze wyniki wykazały, że HA znacznie zmniejsza ekspresję mRNA ASMA i kolagenu I przez miofibroblasty w porównaniu z kontrolami bez HA. Leczenie HA po wstępnym podaniu 5FU (10 mg/ml) skutkowało większym zmniejszeniem ekspresji ASMA i kolagenu I w porównaniu z samym leczeniem HA, a istotność statystyczna została osiągnięta przy dawce 23 mg/ml HA (p

Nasz zespół badaczy zakończył eksperymenty badające uwalnianie 5FU z mieszaniny 5FU/HA. Roztwór lub proszek 5FU mieszano mechanicznie i mieszano na worteksie w HA, a uwalnianie 5FU oceniano ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Stosowane stężenie 5FU wynosiło 10 mg/ml, a stosowane stężenie HA wynosiło 10, 14 i 23 mg/ml.

Mieszanka 5FU/HA opóźniała uwalnianie leku do 48 godzin, przy HA 14mg/ml i 23mg/ml wykazując większe opóźnienie w uwalnianiu leku niż 10mg/ml, (p

Wyniki naszych badań in vitro i testów uwalniania leku pokazują, że ta mieszanina 5FU/HA ma pożądany efekt terapeutyczny na miofibroblasty czopów ludzkich. Optymalne stężenie HA to 23mg/ml i powinno być połączone z 5FU 10mg/ml. Oczekujemy, że 5FU zostanie uwolnione z mieszaniny w ciągu 48 godzin; zarówno HA, jak i 5FU będą miały działanie przeciwbliznowaciejące w przestrzeni podspojówkowej.

Rekrutacja pacjentów:

Pacjenci będą rekrutowani i randomizowani podczas pierwszej wizyty pooperacyjnej, na której wskazane jest wstrzyknięcie 5-FU zgodnie z parametrami klinicznymi wskazującymi na aktywne tworzenie blizny. (zwykle po pierwszym miesiącu pooperacyjnym, kiedy zakończono zakładanie szwów). Cała opieka pooperacyjna z wyjątkiem iniekcji mieszaniny 5FU/lepkosprężystej w grupie kontrolnej pozostanie niezmieniona w stosunku do obecnych standardów leczenia.

Co najmniej 50 pacjentów, którzy przeszli trabekulektomię w Singapurskim Narodowym Centrum Okulistycznym, zostanie zrekrutowanych do badania z klinik DrDeramus w Singapurskim Narodowym Centrum Okulistycznym. Będzie to składało się z różnych rodzajów jaskry. 25 pacjentów otrzyma podspojówkowe wstrzyknięcie 5FU po nakłuciu pęcherzykowym, a 25 otrzyma wstrzyknięcie preparatu 5FU/lepkosprężystego.

Ocena i badanie pacjenta na początku badania

Wszyscy pacjenci (przypadki i grupa kontrolna) zostaną poddani następującym badaniom: ostrość wzroku Snellena, badanie przedniego odcinka w lampie szczelinowej, pomiar pęcherzyka i ciśnienia wewnątrzgałkowego tonometrem Goldmanna. Tonometria zostanie również przeprowadzona przed wstrzyknięciem za pomocą pneumatonometru (Reichert) zgodnie z wytycznymi producenta.

Kolorowe fotografie pęcherzyka zostaną przechwycone i zapisane cyfrowo w celu oceny zamaskowanych pęcherzyków. Visante OCT zostanie użyty do zobrazowania morfologii pęcherzyków w ciemnych warunkach. Jest to nowy bezkontaktowy instrument, który szybko uzyskuje obrazy kąta o wysokiej rozdzielczości. Skanowanie przechwytywania obrazu zajmuje mniej niż 10 sekund i przypomina robienie zdjęcia. Urządzenie umożliwia jakościowe i ilościowe obrazowanie kątowe, które jest obiektywne i powtarzalne. Odbędzie się to przed zabiegiem igłowania.

Nakłuwanie pęcherzyków i iniekcja podspojówkowa

Po uzyskaniu świadomej zgody od pacjenta, pacjent zostanie przydzielony do grupy przypadku lub grupy kontrolnej. W skrócie, nakłucie pęcherzyka spojówkowego zostanie przeprowadzone przy lampie szczelinowej przy użyciu techniki aseptycznej. Lekarz wykonujący zabieg użyje sterylnych rękawiczek i przeczyści powieki oraz skórę wokół oczodołów pacjenta 10% powidonem jodowym. Oko zostanie znieczulone Guttae Tetracaine 0,5% i wstawiony wziernik w celu rozdzielenia powiek. Powidon jodowany jest wprowadzany do worka spojówkowego. 0,1 ml lignokainy 2% wstrzykuje się do przestrzeni podspojówkowej, skroniowej lub nosowej do pęcherzyka przed wykonaniem nakłucia pęcherzyka igłą 27 G połączoną ze strzykawką 1 ml. Roztwór 5FU (10 mg/ml) (grupa kontrolna) lub preparat 5FU/lepkosprężysty (10 mg/ml 5FU w 23 mg/ml HA, (50/50) objętość/objętość) (ramię eksperymentalne) wstrzykuje się za pęcherzykiem po nakłuciu kompletny. Zastrzyki podaje się w tym samym kwadrancie co pęcherzyk. Po wstrzyknięciu worek spojówkowy jest dokładnie płukany i ponownie badany w lampie szczelinowej. IOP jest sprawdzane na koniec procedury za pomocą tonometru Goldmanna i pneumotonometru.

Pacjenci otrzymają aktualny standard opieki w odniesieniu do śródoperacyjnej terapii przeciwwłóknieniowej oraz czasu i częstotliwości pooperacyjnego podawania 5-FU. Dalsze podawanie podspojówkowego roztworu 5-FU lub preparatu 5FU/HA (w zależności od ramienia leczenia, do którego pacjent został pierwotnie przydzielony) podczas kolejnych wizyt w gabinecie będzie podawane, jeśli będzie to wymagane, zgodnie z aktualną praktyką kliniczną dla pacjentów w obu ramionach leczenia. Zostanie to odnotowane w badaniu.

Badania kontrolne

Obrazowanie pęcherzyków z pomiarami OCT i IOP przedniego odcinka Visante będzie rejestrowane podczas każdej wizyty, tj. w 1. i 12. tygodniu. Konieczność dalszego nakłuwania lub innej interwencji, np. masażu/zdjęcia szwów/lizy (jeśli dotyczy) zostanie klinicznie podjęta przez okulistę podczas każdej wizyty, a obrazowanie pęcherzyków zostanie wykonane przed wykonaniem jakichkolwiek dodatkowych zabiegów, jeśli przypadnie na wizytę badawczą, tj. tydzień 1 lub 12. Ocena pęcherzyków na podstawie fotografii w lampie szczelinowej zostanie przeprowadzona na początku wstępnego wstrzyknięcia iw 12. tygodniu.