5FU vs 5FU con formulazione viscoelastica per la prevenzione delle cicatrici post-trabeculectomia

Obiettivi specifici

Lo scopo di questo studio è determinare se la puntura della bolla congiuntivale dopo trabeculectomia con iniezione sottocongiuntivale di una formulazione di 5 fluorouracile (5FU)/viscoelastico sia un metodo efficace per la somministrazione prolungata del farmaco nella prevenzione delle cicatrici post-operatorie nella congiuntiva.

Progettazione dello studio

Esperimenti di coltura cellulare

Sono stati condotti esperimenti di coltura cellulare per determinare l'effetto dell'acido ialuronico, a diverse concentrazioni disponibili in commercio, sui fibroblasti umani di Tenon, il tipo di cellula bersaglio della miscela HA/5FU proposta. Eseguiamo anche test per esaminare i profili farmacocinetici di rilascio dei farmaci delle diverse formulazioni di 5FU/HA. Questo ci ha permesso di determinare la formulazione più efficace da utilizzare per i pazienti nel braccio clinico dello studio.

In breve, i fibroblasti di Tenon umani ottenuti da espianti di tessuto da occhi di cadavere sono stati cresciuti fino a confluire nel siero di vitello fetale contenente gli antibiotici standard per la coltura tissutale, gentamicina e amfotericina, e posti in un incubatore a 37°C al 95% di umidità con il 5% di CO2. Le cellule sono state fatte passare quando confluenti e utilizzate per esperimenti tra i passaggi 3-6.

Espressione dell'actina della muscolatura liscia alfa I fibroblasti di Tenon sono stati seminati su piastre da 24 pozzetti e incubati in siero di vitello fetale (FCS) contenente gli antibiotici standard per la coltura tissutale, gentamicina e amfotericina, e posti in un incubatore a 37°C con un'umidità del 95% con il 5% CO2. Il terreno di coltura è stato rimosso dopo 24 ore e sostituito con terreno fresco descritto di seguito.

Produzione di collagene I Per quantificare la produzione di collagene da parte dei fibroblasti trattati con diverse concentrazioni di HA sono stati impiegati gel standard di collagene I 3-D seminati con fibroblasti per saggi di contrazione del gel. I gel trattati con TGF beta (un noto stimolatore della sintesi del collagene I e induttore dell'espressione dell'actina alfa della muscolatura liscia, cioè il fenotipo del miofibroblasto) hanno agito come controllo positivo. Il collagene di tipo I derivato dalla coda di ratto è stato miscelato con il terreno di coltura e dopo la confluenza, le cellule tripsinizzate sono state risospese in questa miscela e gettate in una piastra a 24 pozzetti e lasciate polimerizzare in un incubatore a 37°C. Dopo la polimerizzazione, i gel sono stati delicatamente staccati dalle piastre in cui sono fusi e sospesi nel mezzo fresco descritto di seguito

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia e ripetuti 3 volte.

I fibroblasti di Tenon umano sono stati coltivati ​​in terreni freschi contenenti solo HA, 5-FU/HA (concentrazioni di HA 10, 14, 23 mg/ml) o coltivati ​​senza HA o 5FU (controlli). La fibrosi e la risposta cicatriziale dei miofibroblasti sono state valutate attraverso l'espressione del collagene I e dell'actina del muscolo liscio alfa (ASMA) che sono state quantificate mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Il test WST-1 ha determinato la vitalità cellulare. La soluzione o la polvere di 5-FU è stata dispersa in HA e agitata meccanicamente e quindi miscelata su vortex.

I nostri risultati hanno mostrato che l'HA ha ridotto notevolmente l'espressione di ASMA e collagene I mRNA da parte dei miofibroblasti rispetto ai controlli senza HA. Il trattamento con HA dopo il pretrattamento con 5FU (10 mg/ml) ha determinato una maggiore riduzione dell'espressione di ASMA e collagene I rispetto al solo trattamento con HA e la significatività statistica è stata raggiunta con 23 mg/ml di HA (p

Il nostro team di ricercatori ha completato gli esperimenti esaminando il rilascio di 5FU dalla miscela 5FU/HA. La soluzione o la polvere di 5FU è stata agitata meccanicamente e miscelata su vortex in HA e il rilascio di 5FU è stato quantificato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). La concentrazione di 5FU usata era di 10 mg/ml e la concentrazione di HA usata era di 10, 14 e 23 mg/ml.

La miscela 5FU/HA ha ritardato il rilascio del farmaco a 48 ore, con HA di 14 mg/ml e 23 mg/ml che mostra un ritardo maggiore nel rilascio del farmaco rispetto a 10 mg/ml, (p

I risultati dei nostri studi in vitro e dei test di rilascio del farmaco dimostrano che questa miscela 5FU/HA ha l'effetto terapeutico desiderato sui miofibroblasti di Human Tenon. La concentrazione ottimale per l'HA è di 23 mg/ml e sarebbe combinata con 5FU 10 mg/ml. Ci aspettiamo che il 5FU venga rilasciato dalla miscela in 48 ore; sia HA che 5FU avranno effetti anti-cicatrizzazione nello spazio subcongiuntivale.

Reclutamento dei pazienti:

I pazienti saranno reclutati e randomizzati alla prima visita postoperatoria in cui è indicata un'iniezione di 5-FU in base a parametri clinici che indicano la formazione di cicatrici attive. (di solito dopo il primo mese post-operatorio quando la suturalisi è stata completata). Tutte le cure postoperatorie, a parte l'iniezione della miscela 5FU/viscoelastica nel gruppo di controllo, rimarranno invariate rispetto agli attuali standard di trattamento.

Almeno 50 pazienti sottoposti a trabeculectomia presso il Singapore National Eye Centre saranno reclutati nello studio dalle cliniche del glaucoma presso il Singapore National Eye Centre. Questo consisterà in diversi tipi di glaucoma. 25 pazienti riceveranno l'iniezione subcongiuntivale di 5FU dopo la puntura di bleb, mentre 25 riceveranno iniezioni di una formulazione 5FU/viscoelastica.

Valutazione ed esame del paziente al basale

Tutti i pazienti (casi e controlli) verranno sottoposti al seguente esame: acuità visiva di Snellen, esame con lampada a fessura del segmento anteriore, misurazione del bleb e della pressione intraoculare con tonometro Goldmann. La tonometria verrà eseguita anche prima dell'iniezione utilizzando un pneumatonometro (Reichert) secondo le linee guida del produttore.

Le fotografie a colori del bleb verranno acquisite e archiviate digitalmente per la classificazione del bleb mascherato. Il Visante OCT verrà utilizzato per visualizzare la morfologia del bleb in condizioni di oscurità. È un nuovo strumento senza contatto che ottiene rapidamente immagini ad alta risoluzione dell'angolo. La scansione dell'acquisizione dell'immagine richiede meno di 10 secondi ed è simile allo scatto di una fotografia. Il dispositivo consente l'imaging angolare qualitativo e quantitativo, oggettivo e riproducibile. Ciò avverrà prima della procedura di agugliatura.

Bleb needling e iniezione subcongiuntivale

Dopo aver ottenuto il consenso informato dal paziente, il paziente verrà assegnato al caso o al gruppo di controllo. In sintesi, la puntura della bolla congiuntivale verrà effettuata alla lampada a fessura con tecnica asettica. Il medico che esegue la procedura utilizzerà guanti sterili e pulirà le palpebre e la pelle peri-orbitale del paziente con iodio povidone al 10%. L'occhio sarà anestetizzato con Guttae Tetracaine 0,5% e uno speculum metallico inserito per separare le palpebre. Lo iodio povidone viene inserito nel sacco congiuntivale. 0,1 ml di lignocaina al 2% vengono iniettati nello spazio subcongiuntivale, temporale o nasale della bolla prima che la puntura della bolla venga eseguita con un ago calibro 27 collegato a una siringa da 1 ml. La soluzione di 5FU (10 mg/ml) (braccio di controllo) o la formulazione di 5FU/viscoelastico (10 mg/ml di 5FU in 23 mg/ml di HA, (50/50) volume/volume) (braccio sperimentale) viene iniettata posteriormente alla bolla dopo l'ago completare. Le iniezioni vengono effettuate all'interno dello stesso quadrante della bolla. Dopo l'iniezione, il sacco congiuntivale viene accuratamente risciacquato e riesaminato con la lampada a fessura. La PIO viene controllata al termine della procedura utilizzando il tonometro Goldmann e il pneumotonometro.

I pazienti riceveranno l'attuale standard di cura per quanto riguarda la terapia antifibrosi intraoperatoria e la tempistica e la frequenza del 5-FU postoperatorio. L'ulteriore somministrazione della soluzione subcongiuntivale di 5-FU o della formulazione di 5FU/HA (a seconda del braccio di trattamento a cui il paziente è stato inizialmente assegnato) nelle successive visite ambulatoriali sarà somministrata quando richiesto secondo l'attuale pratica clinica per i pazienti in entrambi i bracci di trattamento. Questo sarà registrato nello studio.

Esami successivi

L'imaging del bleb con le misurazioni OCT e IOP del segmento anteriore Visante verrà registrato ad ogni visita, cioè la settimana 1 e 12. La necessità di ulteriori punture o altri interventi, ad esempio massaggio/rimozione della sutura/lisi (se pertinente), sarà decisa clinicamente dall'oftalmologo ad ogni visita e l'imaging del bleb verrà eseguito prima di qualsiasi procedura aggiuntiva eseguita se si tratta di una visita di ricerca, ad esempio la settimana 1 o 12. La classificazione delle bleb dalle fotografie con lampada a fessura sarà eseguita al basale prima dell'iniezione e alla settimana 12.