5FU vs 5FU viskoelastisella formulaatiolla estämään arpeutumista trabekulektomian jälkeen

Erityiset tavoitteet

Tämän tutkimuksen tavoitteena on määrittää, onko sidekalvon neulaus trabekulektomian jälkeen 5 fluorourasiilin (5FU)/viskoelastisen formulaation subkonjunktivaalisella injektiolla tehokas menetelmä pitkäaikaiseen lääkkeen antamiseen sidekalvon leikkauksen jälkeisen arpeutumisen estämisessä.

Opintojen suunnittelu

Soluviljelykokeet

Soluviljelykokeet suoritettiin hyaluronihapon vaikutuksen määrittämiseksi erilaisilla kaupallisesti saatavilla olevilla pitoisuuksilla ihmisen Tenonin fibroblasteihin, jotka ovat ehdottamamme HA/5FU-seoksen kohdesolutyyppi. Suoritamme myös testejä tutkiaksemme eri 5FU/HA-formulaatioiden farmakokineettisiä lääkkeiden vapautumisprofiileja. Tämän ansiosta pystyimme määrittämään tehokkaimman formulaation käytettäväksi potilaille tutkimuksen kliinisen osan.

Lyhyesti sanottuna ihmisen Tenonin fibroblasteja, jotka oli saatu kudoseksplanteista ruumiinsilmistä, kasvatettiin, kunnes ne konfluentoitiin vasikan sikiön seerumissa, joka sisälsi kudosviljelmän standardiantibiootteja, gentamysiiniä ja amfoterisiinia, ja asetettiin inkubaattoriin 37 °C:seen 95 %:n kosteudessa ja 5 % CO2:ssa. Solut siirrostettiin, kun ne olivat konfluentteja, ja niitä käytettiin kokeisiin jaksojen 3-6 välillä.

Alfa-sileän lihaksen aktiinin ilmentyminen Tenonin fibroblastit kylvettiin 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin vasikan sikiön seerumissa (FCS), joka sisälsi kudosviljelmän standardiantibiootteja, gentamysiiniä ja amfoterisiinia, ja asetettiin inkubaattoriin 37 °C:seen 95 %:n kosteudessa ja 5 %:ssa. CO2. Viljelyalusta poistettiin 24 tunnin kuluttua ja korvattiin tuoreella alla kuvatulla alustalla.

Kollageeni I:n tuotanto Tavallisia 3-D kollageeni I -geelejä, joihin oli ympätty fibroblasteja geelin supistumismäärityksiä varten, käytettiin eri HA-konsentraatioilla käsiteltyjen fibroblastien kollageenituotannon kvantifiointiin. TGF-beetalla (tunnettu kollageeni I -synteesin stimulaattori ja alfa-sileiden lihasten aktiinin ilmentymisen indusoija eli myofibroblastifenotyyppi) käsitellyt geelit toimivat positiivisena kontrollina. Tyypin I kollageeni, joka oli peräisin rotan hännästä, sekoitettiin viljelyalustaan ​​ja konfluenssin jälkeen trypsinoidut solut suspendoitiin uudelleen tähän seokseen ja valettiin 24-kuoppaiselle levylle ja annettiin polymeroitua inkubaattorissa 37 °C:ssa. Polymeroinnin jälkeen geelit irrotettiin varovasti levyistä, joille ne valetaan, ja suspendoitiin alla kuvattuun tuoreeseen väliaineeseen.

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin 3 kertaa.

Ihmisen Tenonin fibroblasteja viljeltiin tuoreessa alustassa, joka sisälsi HA:ta yksin, 5-FU/HA:ta (HA-pitoisuudet 10, 14, 23 mg/ml) tai viljeltiin ilman HA:ta tai 5FU:ta (kontrollit). Myofibroblastien fibroosi- ja arpeutumisvaste arvioitiin kollageeni I:n ja alfa sileän lihaksen aktiinin (ASMA) ilmentymisen avulla, jotka kvantifioitiin reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR). WST-1-määritys määritti solujen elinkelpoisuuden. 5-FU-liuos tai -jauhe dispergoitiin HA:han ja sekoitettiin mekaanisesti ja sekoitettiin sitten vorteksilla.

Tuloksemme osoittivat, että HA vähensi merkittävästi myofibroblastien ASMA- ja kollageeni I-mRNA:n ilmentymistä verrattuna kontrolleihin, joissa ei ollut HA:ta. Käsittely HA:lla 5FU:n (10 mg/ml) esikäsittelyn jälkeen johti suurempaan vähenemiseen ASMA:n ja kollageeni I:n ilmentymisessä verrattuna pelkkään HA-hoitoon, ja tilastollinen merkitsevyys saavutettiin 23 mg/ml HA:lla (p

Tutkijaryhmämme on saanut päätökseen kokeet, joissa tutkitaan 5FU:n vapautumista 5FU/HA-seoksesta. 5FU-liuosta tai -jauhetta sekoitettiin mekaanisesti ja vortex-sekoitettiin HA:ssa ja 5FU:n vapautuminen määritettiin käyttämällä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC). Käytetyn 5FU:n pitoisuus oli 10 mg/ml ja käytetyn HA:n pitoisuus oli 10, 14 ja 23 mg/ml.

5FU/HA-seos viivästytti lääkkeen vapautumista 48 tuntiin, HA:n ollessa 14 mg/ml ja 23 mg/ml, mikä osoitti suurempaa viivettä lääkkeen vapautumisessa kuin 10 mg/ml, (p

In vitro -tutkimustemme ja lääkeaineen vapautumismäärityksemme tulokset osoittavat, että tällä 5FU/HA-seoksella on haluttu terapeuttinen vaikutus ihmisen Tenonin myofibroblasteihin. HA:n optimaalinen pitoisuus on 23 mg/ml ja se yhdistettäisiin 5FU:n 10 mg/ml kanssa. Odotamme, että 5FU vapautuisi seoksesta 48 tunnin aikana; sekä HA:lla että 5FU:lla on arpeutumista estäviä vaikutuksia sidekalvonalaisessa tilassa.

Potilaiden rekrytointi:

Potilaat rekrytoidaan ja satunnaistetaan ensimmäisellä postoperatiivisella käynnillä, jossa 5-FU-injektio on indikoitu aktiiviseen arven muodostumiseen viittaavien kliinisten parametrien mukaisesti. (yleensä ensimmäisen leikkauksen jälkeisen kuukauden jälkeen, kun suturelyysi on suoritettu). Kaikki leikkauksen jälkeinen hoito 5FU/viskoelastinen seos-injektiota lukuun ottamatta kontrolliryhmässä pysyy ennallaan nykyisiin hoitostandardeihin verrattuna.

Vähintään 50 potilasta, joille on tehty trabekulektomia Singaporen kansallisessa silmäkeskuksessa, rekrytoidaan tutkimukseen Singaporen kansallisen silmäkeskuksen glaukoomaklinikoilta. Tämä koostuu erilaisista glaukoomista. 25 potilasta saa sidekalvon alle ruiskeena 5FU-injektiona bleb-neulauksen jälkeen ja 25 potilasta 5FU/viskoelastista formulaatiota.

Potilaan arviointi ja tutkimus lähtötilanteessa

Kaikille potilaille (tapauksille ja verrokkeille) tehdään seuraava tutkimus: Snellenin näöntarkkuus, etuosan rakolamppututkimus, bleb ja silmänpaineen mittaus Goldmann-tonometrillä. Tonometria suoritetaan myös ennen injektiota pneumatonometrilla (Reichert) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Värivalokuvat blebistä otetaan ja tallennetaan digitaalisesti naamioituja bleb-luokitusta varten. Visante OCT:tä käytetään bleb-morfologian kuvaamiseen pimeissä olosuhteissa. Se on uusi kosketukseton instrumentti, joka saa nopeasti korkearesoluutioisia kuvia kulmasta. Kuvanotto skannaus kestää alle 10 sekuntia ja muistuttaa valokuvaamista. Laite mahdollistaa laadullisen ja kvantitatiivisen kulmakuvauksen, joka on objektiivinen ja toistettava. Tämä tapahtuu ennen neulausta.

Bleb-neulaus ja subkonjunktivaalinen injektio

Kun potilas on antanut tietoisen suostumuksen, potilas luokitellaan joko tapaus- tai kontrolliryhmään. Lyhyesti sanottuna sidekalvon neulaus suoritetaan rakolampussa aseptisella tekniikalla. Toimenpiteen suorittava lääkäri käyttää steriilejä käsineitä ja puhdistaa potilaan silmäluomet ja silmänympärysihon 10 % povidonijodilla. Silmä nukutetaan Guttae Tetracaine 0,5 %:lla ja tähystin asetetaan silmäluomien erottamiseksi. Povidonijodi asetetaan sidekalvopussiin. 0,1 ml lignokaiinia 2 % ruiskutetaan sidekalvon alle, temporaalisesti tai nenän kautta bleb-kohtaan, ennen kuin bleb neulataan 27 G:n neulalla, joka on kiinnitetty 1 ml:n ruiskuun. 5FU-liuos (10 mg/ml) (kontrollihaara) tai 5FU/viskoelastinen formulaatio (10 mg/ml 5FU:ta 23 mg/ml HA:ssa, (50/50) tilavuus/tilavuus) (kokeellinen käsivarsi) ruiskutetaan tulpan taakse neulauksen jälkeen saattaa loppuun. Injektiot annetaan samassa kvadrantissa kuin bleb. Injektion jälkeen sidekalvopussi huuhdellaan perusteellisesti ja tutkitaan uudelleen rakolampulla. IOP tarkistetaan toimenpiteen lopussa Goldmannin tonometrillä ja pneumotonometrillä.

Potilaat saavat nykyisen standardin mukaista hoitoa leikkauksensisäisen antifibroosihoidon sekä postoperatiivisen 5-FU:n ajoituksen ja tiheyden suhteen. Subkonjunktiivisen 5-FU-liuoksen tai 5FU/HA-formulaation (riippuen siitä, mihin hoitoryhmään potilas alun perin määrättiin) jatkoannosta annetaan myöhemmillä vastaanottokäynneillä tarvittaessa molempien hoitoryhmien potilaille nykyisen kliinisen käytännön mukaisesti. Tämä kirjataan tutkimukseen.

Seurantatutkimukset

Bleb-kuvaus Visanten anteriorisen segmentin OCT- ja silmänpainemittauksilla tallennetaan jokaisella käynnillä eli viikolla 1 ja 12. Silmälääkäri päättää kliinisesti jokaisen käynnin yhteydessä lisäneulauksen tai muun toimenpiteen, esim. hieronnan/ompeleen poiston/lyysin tarpeen, ja bleb-kuvaus tehdään ennen lisätoimenpiteitä, jos se osuu tutkimuskäynnille eli viikolle 1 tai 12. Rakolampun valokuvien bleb-luokitus suoritetaan lähtötilanteen esiruiskutuksen yhteydessä ja viikolla 12.