Nieinwazyjna diagnostyka prenatalna (NIPD) mukowiscydozy

Niedawny rozwój technik analizy płodowego DNA krążącego we krwi matki otworzył nowe perspektywy dla diagnostyki prenatalnej (PD). Nieinwazyjna PND (NIPD) jest obecnie metodą z wyboru do określania płci płodu (zaburzenia genetyczne związane z chromosomem X) i genotypu rezusów. NIPD zaczyna znajdować zastosowanie w diagnostyce chorób monogenowych dla mutacji transmisji ojcowskiej. Jednak szereg wyzwań technicznych nadal utrudnia rutynowe zastosowania diagnostyczne i należy je rozwiązać, biorąc pod uwagę aspekty kosztów, niezawodności (fałszywie ujemne…) oraz złożoności sprzętu i badań bioinformatycznych.

Badacze proponują opracowanie i walidację analitycznego i klinicznego testu NIPD na mukowiscydozę z krwi matki poprzez analizę krążącego wolnego DNA płodu (cff-DNA), szukając mutacji ojcowskiej w rodzinach z heterozygotycznością związków CFTR.

Metoda testowa oparta na MEMO powiązana z platformą real-time PCR może być wykorzystana do wykrywania śladowych mutacji DNA. Ta technika jest powszechnie stosowana w przypadku mutacji w mozaice (mniej niż 1%) genów typowych dla nowotworów. Pozytywne wykrycie mutacji ojcowskiej jest zawsze sprawdzane za pomocą drugiej techniki mini-sekwencjonowania.

Przed jakimkolwiek konkretnym testem CFTR profil DNA każdej próbki zostanie określony przy użyciu komercyjnego zestawu Mini STR przystosowanego do badania przypadków. Profil trialleliczny dla markerów potwierdzi obecność płodowego DNA w badanej próbce, a tym samym ograniczy liczbę wyników fałszywie ujemnych związanych z brakiem lub niewystarczającą ilością cff-DNA.

Etap walidacji metod analitycznych badaczy zostanie przeprowadzony na sztucznie utworzonych próbkach kontrolnych chimerycznego DNA. Następnie test zostanie zwalidowany klinicznie poprzez retrospektywne badanie surowicy matki od kobiet w ciąży, które były przedmiotem PND lub PGD (preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej) na żądanie CF w laboratorium w okresie badania (2012-2013).

Struktura badaczy jest ośrodkiem referencyjnym dla PGD, PND i NBS (badanie przesiewowe noworodków) mukowiscydozy. Próbki będą pobierane zgodnie z obowiązującymi przepisami. Przygotowanie próbek przedanalitycznych odbywać się będzie w czasie rzeczywistym, a osocze będzie przechowywane do drugiego etapu badań.

Walidacja proponowanych testów pozwoli na:

• Mieć zewnętrzną kontrolę jakości (QC) potwierdzającą obecność drugorzędnego DNA w badanej próbce. Ta kontrola jakości może być stosowana we wszystkich testach NIPD opartych na poszukiwaniu sekwencji genomowej nieobecnej w genomie matki
• Posiadanie wysoce czułej metody wykrywania śladowych zmutowanych DNA, którą można opracować dla nowych testów NIPD w innych chorobach monogenowych poprzez wykrywanie mutacji o tym samym charakterze.

Projekt badaczy, ograniczony do poszukiwania allelu ojcowskiego w rodzinie z heterozygotycznością związku CFTR, jest pierwszym krokiem we wdrażaniu prenatalnej diagnostyki mukowiscydozy, którą badacze zamierzają opracować w celu ograniczenia inwazyjnych procedur.