Diagnóstico pré-natal não invasivo (NIPD) de fibrose cística

O recente desenvolvimento de técnicas para analisar o DNA fetal circulante no sangue materno abriu novas perspectivas para o diagnóstico pré-natal (DP). PND não invasivo (NIPD) é agora o método de escolha para a determinação do sexo fetal (distúrbios genéticos ligados ao cromossomo X) e genótipo rhesus. O NIPD começa a encontrar aplicações no diagnóstico de doenças monogênicas por mutações de transmissão paterna. No entanto, uma série de desafios técnicos ainda dificultam as aplicações diagnósticas na rotina, e devem ser resolvidos levando em consideração os aspectos de custo, confiabilidade (falso negativo...) e complexidade dos equipamentos e estudos de bioinformática.

Os pesquisadores se propõem a desenvolver e validar um teste NIPD analítico e clínico para fibrose cística a partir do sangue materno por meio da análise do DNA fetal livre circulante (cff-DNA), buscando a mutação paterna em famílias com heterozigosidade do composto CFTR.

O método de teste baseado em MEMO associado a uma plataforma de PCR em tempo real pode ser utilizado para a detecção de traços de DNA mutante. Essa técnica é comumente usada para mutações em mosaico (menos de 1%) de genes comuns de câncer. A detecção positiva da mutação paterna é sempre verificada por uma segunda técnica de mini-sequenciamento.

Antes de qualquer teste CFTR específico, o perfil de DNA de cada amostra será determinado usando um kit comercial de Mini STR adaptado para estudo de caso. Um perfil tri-alélico para marcadores provará a presença de DNA fetal no espécime estudado e, assim, limitará os falsos negativos associados à falta ou quantidades insuficientes de cff-DNA.

A etapa de validação dos métodos analíticos dos investigadores será feita em amostras controle de DNA quimérico criadas artificialmente. Em seguida, o teste será validado clinicamente por estudo retrospectivo de soro materno de gestantes, que tenham sido objeto de PND ou PGD (diagnóstico genético pré-implantacional) de FC solicitado em laboratório durante o período do estudo (2012 a 2013).

A estrutura dos investigadores é um centro de referência para PGD, PND e NBS (triagem neonatal) de fibrose cística. As amostras serão coletadas de acordo com as normas vigentes. O tratamento pré-analítico das amostras será feito em tempo real e o plasma será armazenado para a segunda etapa do estudo.

A validação dos testes propostos permitirá:

• Ter um controle externo de qualidade (QC) confirmando a presença de um DNA menor na amostra estudada. Este QC pode ser usado para todos os testes NIPD baseados na busca de uma sequência genômica ausente do genoma materno
• Ter um método altamente sensível para detectar traços de DNA mutante que podem ser desenvolvidos para novos testes NIPD em outras doenças monogênicas, detectando mutações da mesma natureza.

O projeto dos investigadores, limitado à procura do alelo paterno na família com heterozigotia composta CFTR, é um primeiro passo na implementação de uma abordagem de diagnóstico pré-natal da fibrose quística que os investigadores pretendem desenvolver de forma a reduzir procedimentos invasivos.