Diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) della fibrosi cistica

Il recente sviluppo di tecniche per analizzare il DNA fetale circolante nel sangue materno ha aperto nuove prospettive per la diagnosi prenatale (PD). La PND non invasiva (NIPD) è ora il metodo di scelta per la determinazione del sesso fetale (disturbi genetici legati al cromosoma X) e del genotipo Rhesus. NIPD inizia a trovare applicazioni nella diagnosi di malattie monogeniche per mutazioni di trasmissione paterna. Tuttavia, una serie di sfide tecniche ostacolano ancora le applicazioni diagnostiche di routine e devono essere risolte tenendo conto degli aspetti di costo, affidabilità (falso negativo...) e complessità delle apparecchiature e degli studi bioinformatici.

I ricercatori propongono di sviluppare e convalidare un test NIPD analitico e clinico per la fibrosi cistica dal sangue materno mediante analisi del DNA fetale libero circolante (cff-DNA), alla ricerca della mutazione paterna nelle famiglie con eterozigosi del composto CFTR.

Il metodo di prova basato su MEMO associato a una piattaforma per PCR in tempo reale può essere utilizzato per il rilevamento di tracce di DNA mutante. Questa tecnica è comunemente usata per le mutazioni a mosaico (meno dell'1%) dei geni dei tumori comuni. Il rilevamento positivo della mutazione paterna è sempre controllato da una seconda tecnica di mini-sequenziamento.

Prima di qualsiasi test CFTR specifico, il profilo del DNA di ciascun campione sarà determinato utilizzando un kit commerciale di Mini STR adattato allo studio dei casi. Un profilo tri-allelico per i marcatori dimostrerà la presenza di DNA fetale nel campione studiato e limiterà quindi i falsi negativi associati alla mancanza oa quantità insufficienti di cff-DNA.

La fase di validazione dei metodi analitici dei ricercatori sarà effettuata su campioni di controllo di DNA chimerico creati artificialmente. Quindi il test sarà validato clinicamente da uno studio retrospettivo del siero materno di donne in gravidanza, che sono state oggetto di PND o PGD (diagnosi genetica preimpianto) di FC richiesta in laboratorio durante il periodo di studio (2012-2013).

La struttura dei ricercatori è un centro di riferimento per PGD, PND e NBS (screening neonatale) della fibrosi cistica. I campioni saranno raccolti secondo le normative vigenti. Il trattamento pre-analitico del campione sarà effettuato in tempo reale e il plasma verrà conservato per la seconda fase dello studio.

La validazione dei test proposti consentirà:

• Avere un controllo di qualità esterno (CQ) che confermi la presenza di un DNA minore nel campione studiato. Questo QC potrebbe essere utilizzato per tutti i test NIPD basati sulla ricerca di una sequenza genomica assente dal genoma materno
• Avere un metodo altamente sensibile per rilevare tracce di DNA mutante che può essere sviluppato per nuovi test NIPD in altre malattie monogeniche rilevando mutazioni della stessa natura.

Il progetto dei ricercatori, limitato alla ricerca dell'allele paterno nella famiglia con eterozigosi del composto CFTR, è un primo passo nell'implementazione di un approccio di diagnosi prenatale della fibrosi cistica che i ricercatori mirano a sviluppare per ridurre le procedure invasive.