Efeito da Rapamicina nos Biomarcadores Relacionados à Tolerância em Receptores de Transplante de Fígado Estável

Objetivo:Testar em transplantados hepáticos identificados como não tolerantes se a suspensão dos inibidores da calcineurina seguida de tratamento por 6 meses com sirolimus modifica o padrão de expressão do conjunto de genes associados à tolerância

Antecedentes: Sirolimus é uma droga imunossupressora usada para combater a autoimunidade e prevenir a rejeição aguda do enxerto em humanos e tem notáveis ​​propriedades promotoras de tolerância em modelos de transplante animal.

Hipótese/Objetivos Específicos: Nossa hipótese é que o sirolimus promove vias tolerogênicas no transplante hepático humano.

1. Testar em receptores de transplante hepático identificados como não tolerantes se a descontinuação dos inibidores da calcineurina seguida de tratamento de 6 meses com sirolimus modifica o padrão de expressão do conjunto de genes associados à tolerância
2. Testar em receptores de transplante de fígado identificados como não tolerantes se a conversão de inibidores de calcineurina para sirolimus modifica as respostas imunes do tipo memória.
3. Testar em receptores de transplante de fígado identificados como não tolerantes se a conversão da monoterapia com inibidor de calcineurina para sirolimus afeta a frequência, o fenótipo e a função de subconjuntos de linfócitos do sangue periférico potencialmente imunorreguladores
4. Testar em receptores de transplante de fígado identificados como não tolerantes se a conversão de inibidores de calcineurina para sirolimus promove alterações epigenéticas relacionadas à imunorregulação e ao desenvolvimento/progressão do câncer

Métodos propostos: Experimentos de expressão gênica: quantificaremos a expressão no sangue periférico de um conjunto de genes previamente identificados como preditivos de retirada bem-sucedida da imunossupressão em receptores estáveis ​​de transplante hepático. Amostras de sangue serão obtidas antes e 6 meses após a conversão para o tratamento com sirolimus. A medição dos níveis de expressão gênica será realizada empregando TaqMan PCR em tempo real. A classificação dos pacientes nas categorias tolerantes/não tolerantes será realizada utilizando limiares e algoritmos preditivos desenvolvidos em nosso laboratório.

Estudos de imunofenotipagem: quantificaremos no sangue periférico vários subconjuntos de células mononucleares implicados em vias imunorreguladoras antes e 6 meses após a conversão para tratamento com sirolimus. As medições serão realizadas empregando citometria de fluxo.

Ensaios funcionais: iremos isolar células T reguladoras CD4+CD25+ (Treg) do sangue periférico por Sorter antes e 6 meses após a conversão para tratamento com sirolimus. Experimentos de diluição seriada serão conduzidos em um ensaio não específico de antígeno para avaliar as propriedades supressivas relativas de Tregs. Ensaios de IFNg ELISpot serão conduzidos em paralelo empregando células mononucleares de sangue periférico como células respondedoras para medir respostas aloimunes específicas do doador.

Medição da metilação do DNA: o DNA do receptor será extraído de amostras de sangue periférico antes e depois de 6 meses de tratamento com sirolimus e usado para conduzir estudos de metilação de todo o genoma empregando a plataforma ILLUMINA array.

Resultados esperados: Esperamos definir com precisão os efeitos do sirolimus em vias tolerogênicas previamente identificadas em humanos e avaliar a capacidade dessa droga de aumentar a proporção de receptores de fígado submetidos ao desmame da imunossupressão com sucesso.