Medicina de precisão em NL: um estudo de prova de conceito multicêntrico para análise de biomarcadores histopatológicos em biópsia renal

Tamanho da amostra Para este estudo de prova de conceito, nosso objetivo é analisar cerca de 60 amostras de biópsia renal (expansíveis de acordo com os resultados obtidos).

Métodos:

As seguintes variáveis ​​gerais serão coletadas:

• dados demográficos: idade, sexo, etnia.
• dados clínicos sobre LES:
• diagnóstico e dados cronológicos: tempo de diagnóstico de LES, tempo de diagnóstico de NL, tempo de diagnóstico de LES para NL.
• Critérios de classificação ACR SLE de 1997,
• atividade: envolvimento de diferentes órgãos e sistemas pelo SELENA-SLEDAI no momento do diagnóstico de NL e no momento da última avaliação do paciente (ou óbito, se for o caso).
• dano: por item e por domínio de acordo com o Systemic Lupus International Collaborating Clinics Damage Index (SDI) no momento do diagnóstico de NL e no momento da última avaliação do paciente (ou óbito, se aplicável).
• comorbidade: hipertensão arterial, diabetes, dislipidemia, tabagismo, infecções graves, neoplasias, etc. no momento do diagnóstico de NL e da última avaliação do paciente (ou óbito, se for o caso).
• dados laboratoriais no momento do diagnóstico de NL e no momento da última avaliação do paciente (ou óbito, se aplicável):
• sangue (exames gerais): reagentes de fase aguda (velocidade de hemossedimentação e proteína C-reativa), hemograma completo, creatinina, taxa de filtração glomerular, nitrogênio ureico no sangue, testes de função hepática, perfil lipídico.
• sangue (testes sorológicos): complemento (C3 e C4), níveis de anticorpos anti-dsDNA, anticorpos antifosfolípides: anticardiolipina (Ig M e Ig G), anti-beta2GP-1 (Ig M e Ig G), anticoagulante lúpico.
• urina: hematúria, piúria, proteinúria, cilindros.
• marcadores histopatológicos de biópsia renal:
• classe histológica de acordo com a classificação ISN/RPS 2003.
• Índice de atividade do National Institutes of Health (NIH): pontuação (máximo 24) e por item (hipercelularidade endocapilar, neutrófilos/cariorrexe, depósitos hialinos/alças de arame, necrose fibrinoide, crescentes celulares ou fibrocelulares, inflamação intersticial).
• Índice de cronicidade do National Institutes of Health (NIH): pontuação (máximo 12) e por item (glomeruloesclerose global, crescentes fibrosos, atrofia tubular, fibrose intersticial).
• marcadores relacionados a linfócitos B que podem incluir, mas não estão limitados a: CD19, CD20 e CD138.
• marcadores relacionados a BLyS (estimulador de linfócitos B) e suas consequências funcionais que podem incluir, mas não se limitam à expressão de BLyS e seus receptores: BAFF-R, BCMA e TACI.
• marcadores relacionados a outras linhagens celulares que podem incluir, mas não estão limitados a: CD3 para células T e CD68 para macrófagos.
• marcadores cuja determinação na urina se mostrou útil no diagnóstico e acompanhamento de NL, que podem incluir, mas não estão limitados à citocina pró-inflamatória Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) e Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin (NGAL).
• Dados terapêuticos do LES (incluindo duração do tratamento):
• tratamentos para LES antes do diagnóstico de NL: antimaláricos, glicocorticóides (dose máxima), imunossupressores: azatioprina (AZA), micofenolato de mofetil (MMF), ciclofosfamida (CYC); terapias biológicas: belimumabe, rituximabe.
• tratamento de NL: glicocorticóides (dose máxima), imunossupressores: AZA, MMF, CYC; terapias biológicas: belimumabe, rituximabe.
• dados terapêuticos de comorbidades (incluindo duração do tratamento): anti-hipertensivos, antidiabéticos orais, insulina, hipolipemiantes.
• Evolução/prognóstico do LES: dano acumulado pelo uso do SDI (por item e por domínio), acúmulo de comorbidades, infecções graves, falência de órgãos, óbito.

Variáveis ​​serão coletadas para estabelecer diferentes padrões de resposta ao tratamento e evolução da NL:

1. resposta renal completa, definida de acordo com as recomendações EULAR/ERA-EDTA (13): proteinúria <0,5 g/24 horas e TFG estimada (quase) normal.
2. resposta renal parcial, definida de acordo com as recomendações EULAR/ERA-EDTA: ≥50% de redução da proteinúria para níveis subnefróticos e (quase) normal eGFR
3. sem resposta: todos os outros casos.
4. níveis de proteinúria em 12 meses de tratamento,
5. recidiva renal definida como aumento reprodutível em uPCR para >1 g se o valor basal for <0,2 g, para >2 g se o valor basal estiver entre 0,2 g e 1 g, ou mais que o dobro do valor basal se o valor basal foi >1 g E/OU diminuição reprodutível na TFG de >20%, acompanhada de proteinúria (>1 g) e/ou cilindros celulares de hemácias e/ou leucócitos (sim/não e número de surtos), e) tempo até a primeira exacerbação, f) insuficiência renal crônica,
6. doença renal terminal que requer diálise e/ou transplante renal. A coleta de dados será baseada na história clínica dos pacientes incluídos no estudo.

A confidencialidade será respeitada de acordo com o RD 1720/2007 e as Leis de Proteção de Dados. A aprovação será solicitada à Comissão Galega de Ética em Pesquisa Clínica (CEIC) bem como à CEIC de cada centro, se necessário.

ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL E FUNDAMENTAÇÃO Neste projeto usaremos biópsias renais de pacientes com NL. Essas amostras, preservadas em formaldeído a 10% e embebidas em blocos de parafina pelos respectivos Serviços de Anatomia Patológica, correspondem a pacientes com NL que realizaram biópsia renal nos centros participantes do projeto.

O BLyS (estimulador de linfócitos B) desempenha um papel fundamental na fisiopatologia da NL. Portanto, neste estudo iremos focar em marcadores relacionados ao BLyS e suas consequências funcionais. Por um lado, analisaremos entre outros os níveis de expressão de BLyS e seus receptores (BAFF-R, BCMA e TACI), uma vez que os níveis de expressão de BLyS e seus receptores são elevados em biópsias séricas e renais de pacientes com NL e são associada à progressão e gravidade da doença.

Por outro lado, como o BLyS induz a sobrevivência de células B, analisaremos os níveis de expressão de diferentes marcadores de células B, como CD19 e CD20, entre outros. Por fim, analisaremos o marcador plasmocitário CD138, uma vez que a infiltração plasmocitária está associada ao aumento da gravidade da nefrite lúpica. Analisaremos os níveis de expressão de marcadores de outras linhagens celulares como CD3 para células T e CD68 para macrófagos.

Também analisaremos pelo menos 2 biomarcadores cujos níveis urinários em pacientes com NL têm sido associados a um pior prognóstico da NL: a quimiocina MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) e a enzima NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin).

A expressão desses marcadores será inicialmente determinada pela coloração imuno-histoquímica de biópsias renais, que são preservadas em formaldeído. As amostras serão coradas e analisadas principalmente no Serviço de Anatomia Patológica do "Complejo Hospitalario Universitario de Vigo" e nos laboratórios do "Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur" (IISGS), embora os diferentes centros participantes participem deste trabalho na medida do possível e com boa relação custo-benefício para o projeto. Diferentes métodos de quantificação serão utilizados em função dos corantes dos diferentes marcadores.

ANÁLISE ESTATÍSTICA No estudo descritivo, as variáveis ​​numéricas serão expressas como média ± desvio padrão (DP) ou mediana e intervalo interquartílico (IQR), conforme a distribuição seja normal ou não, respectivamente. Estabeleceremos 2 grupos de pacientes, de acordo com a resposta ao tratamento e a evolução clínica do paciente com NL (ou seja, remissão completa sim/não). Para estabelecer diferenças entre os pacientes desses 2 grupos, usaremos o teste χ2 para variáveis ​​categóricas ou o teste exato de Fisher quando as frequências esperadas são pequenas, o teste t-Student para variáveis ​​contínuas normais e o teste U de Mann-Whitney para variáveis ​​com distribuição não normal.

Diferentes métodos para analisar e/ou mitigar o problema de falta de dados serão usados.

A porcentagem de células positivas e a intensidade da coloração serão correlacionadas com os diferentes padrões de resposta ao tratamento e evolução da NL.

Análises de regressão logística linear univariada e multivariada serão realizadas para explorar as relações entre as diferentes variáveis ​​estudadas (clínica, histopatológica, terapêutica...) e a presença de diferentes desfechos renais (variável dependente). Valores de p < 0,05 serão considerados significativos.

Faremos outros métodos estatísticos diferentes de acordo com os resultados que observarmos em nossa análise inicial.

As análises estatísticas serão realizadas pelo Especialista em Estatística do Grupo IRIDIS.

PRAZOS Desenvolvimento do protocolo definitivo: mês 1. Submissão e Aprovação pelo Comitê de Ética: meses 1-3. Identificação e preparação de amostras renais: meses 4-5. Assinaturas de consentimento informado: meses 4-6. Envio de amostras renais: meses 4-6. Estudos anatomopatológicos e laboratoriais: meses 7-12. Revisão de prontuários clínicos: meses 7-12. Monitoramento do banco de dados: meses 13-15. Análise estatística: mês 16. Elaboração do relatório final: mês 17-18.

EQUIPA DE INVESTIGAÇÃO Investigador Principal: Dr. José Mª Pego Reigosa, Especialista em Reumatologia, Complexo Hospitalar Universitario de Vigo. Grupo IRIDIS-VIGO (Investigação em Reumatologia e Doenças Imunomediadas), Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur (IISGS).

Pesquisadores do centro coordenador: Dra. Irene Altabás González (Reumatologista, Complexo Hospitalario Universitário de Vigo, Grupo IRIDIS-VIGO), Dra. Noemí Martínez López de Castro (Farmacêutica Hospitalar, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, Grupo IRIDIS-VIGO), Dra. Carmen Fachal Bermúdez (Nefropatologista, Complexo Hospitalar Universitário de Vigo) e Dr. Samuel García Pérez (Biólogo Molecular, Pesquisador Sênior, Grupo IRIDIS-VIGO).

Centros colaboradores (Serviços de Reumatologia, Nefrologia, Anatomia Patológica): Hospital 12 de octubre (Madrid, Espanha), Hospital Araba (Vitoria, Espanha), Hospital Germans Trias i Pujol (Barcelona, ​​Espanha), Hospital del Mar (Barcelona, ​​Espanha) e Hospital Dr. Negrín (Gran Canaria, Espanha).