Medicina de precisión en NL: estudio multicéntrico de prueba de concepto para el análisis de biomarcadores histopatológicos en biopsia renal

Tamaño de la muestra Para este estudio de prueba de concepto, nuestro objetivo es analizar alrededor de 60 muestras de biopsia renal (ampliable según los resultados obtenidos).

Métodos:

Se recogerán las siguientes variables generales:

• datos demográficos: edad, sexo, etnia.
• datos clínicos sobre LES:
• diagnóstico y datos cronológicos: tiempo de diagnóstico de LES, tiempo de diagnóstico de LN, tiempo de diagnóstico de LES a LN.
• Criterios de clasificación ACR SLE de 1997,
• actividad: afectación de diferentes órganos y sistemas por SELENA-SLEDAI al momento del diagnóstico de NL y al momento de la última evaluación del paciente (o muerte, si corresponde).
• daño: por ítem y por dominio según Systemic Lupus International Collaborating Clinics Damage Index (SDI) al momento del diagnóstico de NL y al momento de la última evaluación del paciente (o muerte, si corresponde).
• comorbilidad: hipertensión arterial, diabetes, dislipemia, tabaquismo, infecciones graves, neoplasias, etc. en el momento del diagnóstico de la NL y en el momento de la última evaluación del paciente (o fallecimiento, en su caso).
• datos de laboratorio al momento del diagnóstico de NL y al momento de la última evaluación del paciente (o muerte, si corresponde):
• sangre (pruebas generales): reactantes de fase aguda (velocidad de sedimentación globular y proteína C reactiva), hemograma, creatinina, filtrado glomerular, nitrógeno ureico en sangre, pruebas de función hepática, perfil lipídico.
• sangre (pruebas serológicas): complemento (C3 y C4), niveles de anticuerpos anti-dsDNA, anticuerpos antifosfolípidos: anticardiolipina (Ig M e Ig G), anti-beta2GP-1 (Ig M e Ig G), anticoagulante lúpico.
• orina: hematuria, piuria, proteinuria, cilindros.
• Marcadores histopatológicos de biopsia renal:
• clase histológica según la clasificación ISN/RPS de 2003.
• Índice de actividad de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH): puntuación (máximo 24) y por ítem (hipercelularidad endocapilar, neutrófilos/cariorrexis, depósitos hialinos/asas de alambre, necrosis fibrinoide, medias lunas celulares o fibrocelulares, inflamación intersticial).
• Índice de cronicidad de los Institutos Nacionales de Salud (NIH): puntuación (máximo 12) y por ítem (glomeruloesclerosis global, semilunas fibrosas, atrofia tubular, fibrosis intersticial).
• marcadores relacionados con los linfocitos B que pueden incluir, entre otros: CD19, CD20 y CD138.
• marcadores relacionados con BLyS (estimulador de linfocitos B) y sus consecuencias funcionales que pueden incluir, entre otras, la expresión de BLyS y sus receptores: BAFF-R, BCMA y TACI.
• marcadores relacionados con otros linajes celulares que pueden incluir pero no se limitan a: CD3 para células T y CD68 para macrófagos.
• marcadores cuya determinación en orina ha demostrado ser útil en el diagnóstico y seguimiento de la NL que pueden incluir, entre otros, la citoquina proinflamatoria Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) y la Lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL).
• Datos terapéuticos del LES (incluida la duración del tratamiento):
• tratamientos para el LES previo al diagnóstico de NL: antipalúdicos, glucocorticoides (dosis máxima), inmunosupresores: azatioprina (AZA), micofenolato de mofetilo (MMF), ciclofosfamida (CYC); terapias biológicas: belimumab, rituximab.
• tratamiento de NL: glucocorticoides (dosis máxima), inmunosupresores: AZA, MMF, CYC; terapias biológicas: belimumab, rituximab.
• datos terapéuticos de comorbilidades (incluida la duración del tratamiento): agentes antihipertensivos, antidiabéticos orales, insulina, fármacos hipolipemiantes.
• Evolución/pronóstico del LES: daño acumulado por uso de SDI (por ítem y por dominio), acumulación de comorbilidades, infecciones graves, falla orgánica, muerte.

Se recogerán variables para establecer diferentes patrones de respuesta al tratamiento y evolución de la NL:

1. respuesta renal completa, definida según las recomendaciones EULAR/ERA-EDTA (13): proteinuria <0,5 g/24 horas y FG estimado (casi) normal.
2. respuesta renal parcial, definida de acuerdo con las recomendaciones EULAR/ERA-EDTA: ≥50 % de reducción de proteinuria a niveles subnefróticos y eGFR (casi) normal
3. sin respuesta: todos los demás casos.
4. niveles de proteinuria a los 12 meses de tratamiento,
5. recaída renal definida como un aumento reproducible en uPCR a >1 g si el valor inicial era <0,2 g, a >2 g si el valor inicial estaba entre 0,2 g y 1 g, o más del doble del valor inicial si el valor inicial fue >1 g Y/O una disminución reproducible en la TFG de >20 %, acompañada de proteinuria (>1 g), y/o cilindros celulares de glóbulos rojos y/o glóbulos blancos (sí/no y número de exacerbaciones), e) tiempo hasta la primera brote, f) insuficiencia renal crónica,
6. enfermedad renal en etapa terminal que requiere diálisis y/o trasplante renal. La recogida de datos se basará en la historia clínica de los pacientes incluidos en el estudio.

Se respetará la confidencialidad de acuerdo con el RD 1720/2007 y la Ley de Protección de Datos. Se solicitará la aprobación del Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia (CEIC) así como del CEIC de cada centro, en caso de ser necesario.

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL Y JUSTIFICACIÓN En este proyecto utilizaremos biopsias renales de pacientes con NL. Estas muestras, conservadas en formol al 10% e incluidas en bloques de parafina por los Servicios de Anatomía Patológica correspondientes, corresponden a pacientes con NL a los que se les realizó biopsia renal en los centros participantes en el proyecto.

BLyS (estimulador de linfocitos B) juega un papel clave en la fisiopatología de la NL. Por tanto, en este estudio nos centraremos en los marcadores relacionados con BLyS y sus consecuencias funcionales. Por un lado, analizaremos entre otros los niveles de expresión de BLyS y sus receptores (BAFF-R, BCMA y TACI), ya que los niveles de expresión de BLyS y sus receptores están elevados en biopsias séricas y renales de pacientes con NL y son asociado con la progresión y la gravedad de la enfermedad.

Por otro lado, debido a que BLyS induce la supervivencia de las células B, analizaremos los niveles de expresión de diferentes marcadores de células B como CD19 y CD20 entre otros. Finalmente, analizaremos el marcador de células plasmáticas CD138, ya que la infiltración de células plasmáticas se asocia con una mayor gravedad de la nefritis lúpica. Analizaremos los niveles de expresión de marcadores de otros linajes celulares como CD3 para células T y CD68 para macrófagos.

También analizaremos al menos 2 biomarcadores cuyos niveles urinarios en pacientes con NL se han asociado a un peor pronóstico de NL: la quimiocina MCP-1 (proteína quimioatrayente de monocitos-1) y la enzima NGAL (lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos).

La expresión de estos marcadores se determinará inicialmente mediante tinción inmunohistoquímica de biopsias renales, que se conservan en formaldehído. Las muestras serán teñidas y analizadas principalmente en el Servicio de Anatomía Patológica del "Complejo Hospitalario Universitario de Vigo" y en los laboratorios del "Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur" (IISGS), aunque en este trabajo participarán los diferentes centros participantes en la medida de lo posible y rentable para el proyecto. Se utilizarán diferentes métodos de cuantificación en función de las tinciones de los diferentes marcadores.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO En el estudio descriptivo, las variables numéricas se expresarán como media ± desviación estándar (DE) o mediana y rango intercuartílico (RIC), según la distribución sea normal o no, respectivamente. Estableceremos 2 grupos de pacientes, según la respuesta al tratamiento y la evolución clínica del paciente con NL (es decir, remisión completa sí/no). Para establecer diferencias entre los pacientes de estos 2 grupos utilizaremos el test de la χ2 para variables categóricas o el test exacto de Fisher cuando las frecuencias esperadas sean pequeñas, el test t-Student para variables continuas normales y el test U de Mann-Whitney para variables con distribución no normal.

Se utilizarán diferentes métodos para analizar y/o mitigar el problema de los datos faltantes.

El porcentaje de células positivas y la intensidad de la tinción se correlacionarán con los diferentes patrones de respuesta al tratamiento y evolución de la NL.

Se realizarán análisis de regresión logística lineal univariante y multivariante para explorar las relaciones entre las diferentes variables estudiadas (clínicas, histopatológicas, terapéuticas...) y la presencia de los diferentes desenlaces renales (variable dependiente). Se considerarán significativos valores de p < 0,05.

Realizaremos otros métodos estadísticos diferentes según los resultados que observemos de nuestro análisis inicial.

Los análisis estadísticos serán realizados por el Especialista en Estadística del Grupo IRIDIS.

PLAZOS Elaboración del protocolo definitivo: mes 1. Presentación y aprobación por el Comité de Ética: meses 1-3. Identificación y preparación de muestras renales: 4-5 meses. Firmas de consentimiento informado: meses 4-6. Envío de muestras renales: meses 4-6. Estudios anatomopatológicos y de laboratorio: meses 7-12. Revisión de historias clínicas: meses 7-12. Seguimiento de la base de datos: meses 13-15. Análisis estadístico: mes 16. Elaboración del informe final: mes 17-18.

EQUIPO DE INVESTIGACIÓN Investigador Principal: Dr. José Mª Pego Reigosa, Especialista en Reumatología, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo. Grupo IRIDIS-VIGO (Investigación en Reumatología y Enfermedades Inmunes), Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur (IISGS).

Investigadores del centro coordinador: Dra. Irene Altabás González (Reumatóloga, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, Grupo IRIDIS-VIGO), Dra. Noemí Martínez López de Castro (Farmacéutica de Hospital, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, Grupo IRIDIS-VIGO), Dra. Carmen Fachal Bermúdez (Nefropatologa, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo) y Dr. Samuel García Pérez (Biólogo Molecular, Investigador Senior, Grupo IRIDIS-VIGO).

Centros colaboradores (Servicios de Reumatología, Nefrología, Anatomía Patológica): Hospital 12 de octubre (Madrid, España), Hospital Araba (Vitoria, España), Hospital Germans Trias i Pujol (Barcelona, ​​España), Hospital del Mar (Barcelona, ​​España) y Hospital Dr. Negrín (Gran Canaria, España).