Precizní medicína v LN: Multicentrická studie Proof-of-Concept pro analýzu histopatologických biomarkerů v renální biopsii

Velikost vzorku Pro tuto studii proof-of-concept je naším cílem analyzovat přibližně 60 vzorků renální biopsie (rozšiřitelných podle získaných výsledků).

Metody:

Budou shromažďovány následující obecné proměnné:

• demografické údaje: věk, pohlaví, etnická příslušnost.
• klinické údaje o SLE:
• diagnóza a chronologické údaje: čas diagnózy SLE, čas diagnózy LN, čas od diagnózy SLE k LN.
• 1997 ACR SLE klasifikační kritéria,
• aktivita: postižení různých orgánů a systémů pomocí SELENA-SLEDAI v době diagnózy LN a v době posledního hodnocení pacienta (případně úmrtí).
• poškození: podle položky a podle domény podle Systemic Lupus International Collaborating Clinics Damage Index (SDI) v době diagnózy LN a v době posledního hodnocení pacienta (případně úmrtí).
• komorbidita: arteriální hypertenze, diabetes, dyslipémie, kouření, těžké infekce, novotvary atd. v době diagnózy LN a v době posledního vyšetření pacienta (případně úmrtí).
• laboratorní údaje v době diagnózy LN a v době posledního hodnocení pacienta (případně úmrtí):
• krev (obecné testy): reaktanty akutní fáze (sedimentace erytrocytů a C-reaktivní protein), úplný krevní obraz, kreatinin, rychlost glomerulární filtrace, dusík močoviny v krvi, jaterní testy, lipidový profil.
• krev (sérologické testy): komplement (C3 a C4), hladiny anti-dsDNA protilátek, antifosfolipidové protilátky: antikardiolipin (Ig M a Ig G), anti-beta2GP-1 (Ig M a Ig G), lupus antikoagulans.
• moč: hematurie, piurie, proteinurie, sádry.
• histopatologické markery renální biopsie:
• histologická třída podle klasifikace ISN/RPS z roku 2003.
• Index aktivity National Institutes of Health (NIH): skóre (maximálně 24) a podle položek (endokapilární hypercelulárnost, neutrofily/karyorexie, hyalinní depozita/drátěné smyčky, fibrinoidní nekróza, buněčné nebo fibrocelulární srpky, intersticiální zánět).
• Index chronicity National Institutes of Health (NIH): skóre (maximálně 12) a podle položek (globální glomeruloskleróza, fibrózní srpky, tubulární atrofie, intersticiální fibróza).
• markery související s B lymfocyty, které mohou zahrnovat, aniž by byl výčet omezující: CD19, CD20 a CD138.
• markery související s BLyS (stimulátor B lymfocytů) a jeho funkční důsledky, které mohou zahrnovat, aniž by byl výčet omezující, expresi BLyS a jeho receptorů: BAFF-R, BCMA a TACI.
• markery související s jinými buněčnými liniemi, které mohou zahrnovat, aniž by byl výčet omezující: CD3 pro T buňky a CD68 pro makrofágy.
• markery, jejichž stanovení v moči se ukázalo jako užitečné při diagnostice a sledování LN, které mohou zahrnovat, aniž by byl výčet omezující, prozánětlivý cytokin Monocyte Chemoatraktant Protein-1 (MCP-1) a Lipocalin spojený s neutrofilní gelatinázou (NGAL).
• SLE terapeutické údaje (včetně délky léčby):
• léčba SLE před diagnózou LN: antimalarika, glukokortikoidy (maximální dávka), imunosupresiva: azathioprin (AZA), mofetilmykofenolát (MMF), cyklofosfamid (CYC); biologické terapie: belimumab, rituximab.
• léčba LN: glukokortikoidy (maximální dávka), imunosupresiva: AZA, MMF, CYC; biologické terapie: belimumab, rituximab.
• terapeutické údaje o komorbiditách (včetně délky léčby): antihypertenziva, perorální antidiabetika, inzulín, hypolipidemika.
• Evoluce/prognóza SLE: nahromaděné poškození pomocí SDI (podle položky a podle domény), narůstání komorbidit, těžké infekce, selhání orgánů, smrt.

Proměnné budou shromážděny, aby se stanovily různé vzorce reakce na léčbu a vývoj LN:

1. kompletní renální odpověď, definovaná podle doporučení EULAR/ERA-EDTA (13): proteinurie <0,5 g/24 hodin a odhadovaná GFR (téměř) normální.
2. částečná renální odpověď, definovaná podle doporučení EULAR/ERA-EDTA: ≥50% snížení proteinurie na subnefrotické hladiny a (téměř) normální eGFR
3. žádná odpověď: všechny ostatní případy.
4. hladiny proteinurie po 12 měsících léčby,
5. renální relaps definovaný jako reprodukovatelné zvýšení uPCR na > 1 g, pokud byla výchozí hodnota < 0,2 g, na > 2 g, pokud byla výchozí hodnota mezi 0,2 g a 1 g, nebo více než dvojnásobek výchozí hodnoty, pokud byla výchozí hodnota byl > 1 g A/NEBO reprodukovatelný pokles GFR o > 20 %, doprovázený proteinurií (> 1 g) a/nebo buněčnými odlitky RBC a/nebo WBC (ano/ne a počet vzplanutí), e) čas do prvního vzplanutí, f) chronické selhání ledvin,
6. konečné stadium onemocnění ledvin vyžadující dialýzu a/nebo transplantaci ledvin. Sběr dat bude založen na klinické anamnéze pacientů zařazených do studie.

Důvěrnost bude respektována v souladu s RD 1720/2007 a zákony o ochraně údajů. Schválení bude požadováno od etického výboru pro klinický výzkum v Galicii (CEIC) a v případě potřeby také od CEIC každého centra.

EXPERIMENTÁLNÍ STRATEGIE A ODŮVODNĚNÍ V tomto projektu budeme využívat renální biopsie od pacientů s LN. Tyto vzorky, konzervované v 10% formaldehydu a zalité v parafinových blocích příslušnými službami anatomické patologie, odpovídají pacientům s LN, kteří podstoupili renální biopsii v centrech účastnících se projektu.

BLyS (stimulátor B lymfocytů) hraje klíčovou roli v patofyziologii LN. Proto se v této studii zaměříme na markery související s BLyS a jeho funkčními důsledky. Na jedné straně budeme analyzovat mimo jiné hladiny exprese BLyS a jeho receptorů (BAFF-R, BCMA a TACI), protože hladiny exprese BLyS a jeho receptorů jsou zvýšené v sérových a renálních biopsiích pacientů s LN a jsou spojené s progresí a závažností onemocnění.

Na druhou stranu, protože BLyS indukuje přežití B buněk, budeme analyzovat hladiny exprese různých markerů B buněk, jako jsou mimo jiné CD19 a CD20. Nakonec budeme analyzovat marker plazmatických buněk CD138, protože infiltrace plazmatickými buňkami je spojena se zvýšenou závažností lupusové nefritidy. Budeme analyzovat hladiny exprese markerů jiných buněčných linií, jako je CD3 pro T buňky a CD68 pro makrofágy.

Budeme také analyzovat alespoň 2 biomarkery, jejichž hladiny v moči u pacientů s LN byly spojeny s horší prognózou LN: chemokin MCP-1 (monocytový chemoatraktant protein-1) a enzym NGAL (neutrofilní gelatináza-asociovaný lipokalin).

Exprese těchto markerů bude zpočátku stanovena imunohistochemickým barvením renálních biopsií, které jsou konzervovány ve formaldehydu. Vzorky budou barveny a analyzovány především v Anatomické patologické službě "Complejo Hospitalario Universitario de Vigo" a v laboratořích "Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur" (IISGS), i když se na této práci budou podílet různá zúčastněná centra. v rozsahu možném a nákladově efektivním pro projekt. Budou použity různé metody kvantifikace ve funkci skvrn různých markerů.

STATISTICKÁ ANALÝZA V deskriptivní studii budou numerické proměnné vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD) nebo medián a interkvartilní rozmezí (IQR), v závislosti na tom, zda je rozdělení normální či nikoli. Sestavíme 2 skupiny pacientů podle odpovědi na léčbu a klinického vývoje pacienta s LN (tj. kompletní remise ano/ne). Ke stanovení rozdílů mezi pacienty v těchto 2 skupinách použijeme χ2 test pro kategorické proměnné nebo Fisherův exaktní test, když jsou očekávané frekvence malé, t-Studentův test pro normální spojité proměnné a Mann-Whitney U test pro proměnné s nenormální distribuce.

K analýze a/nebo zmírnění problému s chybějícími údaji budou použity různé metody.

Procento pozitivních buněk a intenzita barvení budou korelovat s různými vzory odezvy na léčbu a vývojem LN.

Budou provedeny jednorozměrné a vícerozměrné lineární logistické regresní analýzy za účelem prozkoumání vztahů mezi různými studovanými proměnnými (klinickými, histopatologickými, terapeutickými...) a přítomností různých renálních výsledků (závislá proměnná). Hodnoty p < 0,05 budou považovány za významné.

Provedeme další různé statistické metody podle výsledků, které pozorujeme z naší počáteční analýzy.

Statistické analýzy bude provádět statistický specialista skupiny IRIDIS.

LHŮTY Vypracování definitivního protokolu: měsíc 1. Předložení a schválení etickou komisí: měsíce 1-3. Identifikace a příprava renálních vzorků: měsíce 4-5. Podpisy informovaného souhlasu: měsíce 4-6. Odeslání vzorků ledvin: měsíce 4-6. Anatomopatologické a laboratorní studie: měsíce 7-12. Přehled klinických tabulek: měsíce 7-12. Monitoring databáze: měsíce 13-15. Statistická analýza: měsíc 16. Zpracování závěrečné zprávy: měsíc 17.-18.

VÝZKUMNÝ TÝM Hlavní řešitel: Dr. José Mª Pego Reigosa, specialista na revmatologii, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo. Skupina IRIDIS-VIGO (Vyšetřování v revmatologii a imunitně zprostředkovaných chorobách), Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur (IISGS).

Výzkumní pracovníci v koordinačním centru: Dr. Irene Altabás González (revmatolog, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, IRIDIS-VIGO Group), Dr. Noemí Martínez López de Castro (nemocniční farmaceut, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, IRIDIS-VIGO Group), Dr. Carmen Fachal Bermúdez (nefropatolog, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo) a Dr. Samuel García Pérez (molekulární biolog, hlavní výzkumník, IRIDIS-VIGO Group).

Spolupracující centra (revmatologie, nefrologie, patologické anantomické služby): Hospital 12 de octubre (Madrid, Španělsko), Hospital Araba (Vitoria, Španělsko), Hospital Germans Trias i Pujol (Barcelona, ​​Španělsko), Hospital del Mar (Barcelona, ​​Španělsko) a Nemocnice Dr. Negrín (Gran Canaria, Španělsko).