Tarkkuuslääketiede LN:ssä: Monikeskustutkimus munuaisbiopsian histopatologisten biomarkkerien analyysiin

Näytteen koko Tässä proof-of-concept-tutkimuksessa tavoitteenamme on analysoida noin 60 munuaisbiopsianäytettä (laajennettavissa saatujen tulosten mukaan).

Menetelmät:

Seuraavat yleiset muuttujat kerätään:

• väestötiedot: ikä, sukupuoli, etnisyys.
• kliiniset tiedot SLE:stä:
• diagnoosi ja kronologiset tiedot: SLE-diagnoosin aika, LN-diagnoosin aika, SLE-diagnoosin aika LN:hen.
• 1997 ACR SLE -luokituskriteerit,
• aktiivisuus: SELENA-SLEDAI:n eri elinten ja järjestelmien osallistuminen LN-diagnoosin ja potilaan viimeisen arvioinnin (tai tapauksen mukaan kuoleman) aikaan.
• vaurio: kohteittain ja alueittain Systemic Lupus International Collaborating Clinics Damage Indexin (SDI) mukaan LN-diagnoosin ja potilaan viimeisen arvioinnin (tai mahdollisen kuoleman) ajankohtana.
• komorbiditeetti: verenpainetauti, diabetes, dyslipemia, tupakointitottumus, vakavat infektiot, kasvaimet jne. LN-diagnoosin ja potilaan viimeisen arvioinnin (tai mahdollisen kuoleman) aikana.
• laboratoriotiedot LN-diagnoosin ja potilaan viimeisen arvioinnin (tai tarvittaessa kuoleman) aikaan:
• veri (yleiset testit): akuutin vaiheen reagoivat aineet (erytrosyyttien sedimentaationopeus ja C-reaktiivinen proteiini), täysi verenkuva, kreatiniini, glomerulusten suodatusnopeus, veren ureatyppi, maksan toimintakokeet, lipidiprofiili.
• veri (serologiset testit): komplementti (C3 ja C4), anti-dsDNA-vasta-aineiden tasot, antifosfolipidivasta-aineet: antikardiolipiini (Ig M ja Ig G), anti-beta2GP-1 (Ig M ja Ig G), lupus antikoagulantti.
• virtsa: hematuria, piuria, proteinuria, kipsit.
• munuaisbiopsian histopatologiset markkerit:
• histologinen luokka vuoden 2003 ISN/RPS-luokituksen mukaan.
• National Institutes of Healthin (NIH) aktiivisuusindeksi: pisteet (enintään 24) ja kohteittain (endokapillaarinen hypersellulaarisuus, neutrofiilit/karyiorrheksis, hyaliinikertymät/lankasilmukat, fibrinoidinekroosi, solu- tai fibrosolupuoliset puolikuut, interstitiaalinen tulehdus).
• National Institutes of Health (NIH) kroonisuusindeksi: pisteet (enintään 12) ja kohteittain (globaalinen glomeruloskleroosi, kuitupuoliset puolikuut, tubulaarinen atrofia, interstitiaalinen fibroosi).
• B-lymfosyytteihin liittyvät markkerit, joita voivat olla, mutta niihin rajoittumatta: CD19, CD20 ja CD138.
• BLyS:ään (B-lymfosyyttistimulaattoriin) liittyvät markkerit ja sen toiminnalliset seuraukset, joihin voi sisältyä, mutta ei rajoittuen, BLyS:n ja sen reseptorien ekspressio: BAFF-R, BCMA ja TACI.
• markkerit, jotka liittyvät muihin solulinjoihin, joita voivat olla, mutta niihin rajoittumatta: CD3 T-soluille ja CD68 makrofageille.
• markkerit, joiden määrittäminen virtsasta on osoittautunut hyödylliseksi LN:n diagnosoinnissa ja seurannassa, joihin voi sisältyä, mutta ei rajoittuen, proinflammatorinen sytokiini Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) ja neutrofiiligelatinaasiin liittyvä lipokaliini (NGAL).
• SLE:n terapeuttiset tiedot (mukaan lukien hoidon kesto):
• SLE:n hoidot ennen LN:n diagnoosia: malarialääkkeet, glukokortikoidit (maksimiannos), immunosuppressantit: atsatiopriini (AZA), mofetilimykofenolaatti (MMF), syklofosfamidi (CYC); biologiset hoidot: belimumabi, rituksimabi.
• LN:n hoito: glukokortikoidit (maksimiannos), immunosuppressantit: AZA, MMF, CYC; biologiset hoidot: belimumabi, rituksimabi.
• terapeuttiset tiedot liitännäissairauksista (mukaan lukien hoidon kesto): verenpainelääkkeet, suun kautta otettavat diabeteslääkkeet, insuliini, hypolipideemiset lääkkeet.
• SLE:n evoluutio/ennuste: SDI:n aiheuttamat kertyneet vauriot (erittäin ja alueittain), rinnakkaissairauksien kertyminen, vakavat infektiot, elinten vajaatoiminta, kuolema.

Muuttujat kerätään erilaisten vastemallien määrittämiseksi hoitoon ja LN:n kehitykseen:

1. täydellinen munuaisvaste, määritelty EULAR/ERA-EDTA-suositusten mukaisesti (13): proteinuria <0,5 g/24 tuntia ja (lähes) normaali arvioitu GFR.
2. osittainen munuaisvaste, määritelty EULAR/ERA-EDTA-suositusten mukaisesti: ≥50 % proteinurian väheneminen subnefroottiselle tasolle ja (lähes) normaali eGFR
3. ei vastausta: kaikki muut tapaukset.
4. proteinuriatasot 12 kuukauden hoidon jälkeen,
5. munuaisten relapsi, joka määritellään toistettavana uPCR:n lisääntymisenä > 1 g:aan, jos lähtötasoarvo oli < 0,2 g, > 2 g:aan, jos lähtötason arvo oli välillä 0,2 g ja 1 g, tai yli kaksinkertaiseksi lähtötilanteen arvoon, jos lähtötason arvo oli oli > 1 g JA/TAI toistettava GFR:n lasku >20 %, johon liittyi proteinuria (> 1 g) ja/tai punasolujen ja/tai valkosolujen solukipsi (kyllä/ei ja leimahdusten määrä), e) aika ensimmäiseen f) krooninen munuaisten vajaatoiminta,
6. loppuvaiheen munuaissairaus, joka vaatii dialyysiä ja/tai munuaisensiirtoa. Tiedonkeruu perustuu tutkimukseen osallistuneiden potilaiden kliiniseen historiaan.

Luottamuksellisuutta kunnioitetaan RD 1720/2007:n ja tietosuojalakien mukaisesti. Hyväksyntä pyydetään Galician kliinisen tutkimuksen eettiseltä komitealta (CEIC) sekä tarvittaessa kunkin keskuksen CEIC:ltä.

KOKEELLINEN STRATEGIA JA PERUSTELUT Tässä projektissa käytämme munuaisbiopsioita potilailta, joilla on LN. Nämä näytteet, jotka on säilytetty 10 % formaldehydissä ja upotettu parafiinilohkoihin vastaavien anatomisten patologioiden toimesta, vastaavat LN-potilaita, joille tehtiin munuaisbiopsia hankkeeseen osallistuvissa keskuksissa.

BLyS:llä (B-lymfosyyttistimulaattorilla) on keskeinen rooli LN:n patofysiologiassa. Siksi tässä tutkimuksessa keskitymme BLyS:ään ja sen toiminnallisiin seurauksiin liittyviin markkereihin. Toisaalta analysoimme muun muassa BLyS:n ja sen reseptorien (BAFF-R, BCMA ja TACI) ilmentymistasoja, koska BLyS:n ja sen reseptorien ilmentymistasot ovat kohonneita LN-potilaiden seerumi- ja munuaisbiopsioissa ja liittyy taudin etenemiseen ja vakavuuteen.

Toisaalta, koska BLyS indusoi B-solujen eloonjäämistä, analysoimme erilaisten B-solumarkkerien, kuten CD19:n ja CD20:n, ilmentymistasoja mm. Lopuksi analysoimme plasmasolumarkkerin CD138, koska plasmasolujen infiltraatio liittyy lupusnefriitin lisääntyneeseen vakavuusasteeseen. Analysoimme muiden solulinjojen, kuten CD3:n T-soluille ja CD68:n makrofageille, ilmentymistasoja.

Analysoimme myös vähintään kahta biomarkkeria, joiden virtsatasot LN-potilailla on yhdistetty huonompaan LN:n ennusteeseen: kemokiini MCP-1 (monosyyttien kemoattraktanttiproteiini-1) ja entsyymi NGAL (neutrofiiligelatinaaseihin liittyvä lipokaliini).

Näiden markkerien ilmentyminen määritetään aluksi formaldehydissä säilytettyjen munuaisbiopsioiden immunohistokemiallisella värjäyksellä. Näytteet värjätään ja analysoidaan pääasiassa "Complejo Hospitalario Universitario de Vigon" anatomisessa patologiassa ja "Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Surin" (IISGS) laboratorioissa, vaikka eri osallistuvat keskukset osallistuvat tähän työhön. siinä määrin kuin mahdollista ja hankkeen kannalta kustannustehokasta. Erilaisia ​​kvantifiointimenetelmiä käytetään eri merkkiaineiden tahrojen funktiona.

TILASTOINEN ANALYYSI Kuvaavassa tutkimuksessa numeeriset muuttujat ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonna (SD) tai mediaani- ja interkvartiilialue (IQR) riippuen siitä, onko jakauma normaali vai ei. Perustamme 2 potilasryhmää hoitovasteen ja LN-potilaan kliinisen kehityksen mukaan (eli täydellinen remissio kyllä/ei). Näiden kahden ryhmän potilaiden välisten erojen selvittämiseksi käytämme χ2-testiä kategorisille muuttujille tai Fisherin tarkkaa testiä, kun odotetut taajuudet ovat pieniä, t-Student-testiä normaaleille jatkuville muuttujille ja Mann-Whitneyn U-testiä muuttujille, joilla on epänormaali jakautuminen.

Puuttuvan datan ongelman analysointiin ja/tai lieventämiseen käytetään erilaisia ​​menetelmiä.

Positiivisten solujen prosenttiosuus ja värjäytymisintensiteetti korreloivat erilaisten vastemallien kanssa hoitoon ja LN:n kehitykseen.

Yksimuuttujia ja monimuuttujia lineaarisia logistisia regressioanalyysejä tehdään tutkittujen eri muuttujien (kliiniset, histopatologiset, terapeuttiset...) ja erilaisten munuaistulosten (riippuvainen muuttuja) välisten suhteiden tutkimiseksi. Arvoja p <0,05 pidetään merkittävinä.

Toteutamme muita erilaisia ​​tilastollisia menetelmiä alustavan analyysin perusteella havaitsemiemme tulosten mukaan.

Tilastolliset analyysit suorittaa IRIDIS-ryhmän tilastoasiantuntija.

AIKAAJAT Lopullisen pöytäkirjan kehittäminen: kuukausi 1. Toimitus ja hyväksyntä eettisessä toimikunnassa: kk 1-3. Munuaisnäytteiden tunnistaminen ja valmistus: kk 4-5. Tietoisen suostumuksen allekirjoitukset: kk 4-6. Munuaisnäytteiden toimitus: kk 4-6. Anatomopatologiset ja laboratoriotutkimukset: kk 7-12. Katsaus kliinisiin kaavioihin: kk 7-12. Tietokannan seuranta: kk 13-15. Tilastollinen analyysi: kuukausi 16. Loppuraportin valmistelu: kk ​​17-18.

TUTKIMUSRYHMÄ Vastuullinen tutkija: Dr. José Mª Pego Reigosa, reumatologian erikoislääkäri, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo. IRIDIS-VIGO Group (Reumatologian ja immuunivälitteisten sairauksien tutkimus), Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur (IISGS).

Koordinoivan keskuksen tutkijat: tohtori Irene Altabás González (reumatologi, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, IRIDIS-VIGO Group), tohtori Noemí Martínez López de Castro (sairaalan farmaseutti, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, IRIDIS-VIGO Group), Dr. Carmen Fachal Bermúdez (nefropatologi, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo) ja tohtori Samuel García Pérez (molekyylibiologi, vanhempi tutkija, IRIDIS-VIGO Group).

Yhteistyökeskukset (reumatologia, nefrologia, patologinen anantomiapalvelut): Hospital 12 de octubre (Madrid, Espanja), Hospital Araba (Vitoria, Espanja), Hospital Germans Trias i Pujol (Barcelona, ​​Espanja), Hospital del Mar (Barcelona, ​​Espanja) ja Dr. Negrínin sairaala (Gran Canaria, Espanja).