Medicina di precisione in LN: uno studio di prova multicentrico per l'analisi dei biomarcatori istopatologici nella biopsia renale

Dimensione del campione Per questo studio proof-of-concept, il nostro obiettivo è analizzare circa 60 campioni di biopsia renale (espandibili in base ai risultati ottenuti).

Metodi:

Verranno raccolte le seguenti variabili generali:

• dati demografici: età, sesso, etnia.
• dati clinici sul LES:
• diagnosi e dati cronologici: ora della diagnosi di LES, ora della diagnosi di LN, tempo dalla diagnosi di LES alla LN.
• 1997 ACR criteri di classificazione SLE,
• attività: coinvolgimento di diversi organi e sistemi da parte di SELENA-SLEDAI al momento della diagnosi di LN e al momento dell'ultima valutazione del paziente (o del decesso, se applicabile).
• danno: per articolo e per dominio secondo il Systemic Lupus International Collaborating Clinics Damage Index (SDI) al momento della diagnosi di LN e al momento dell'ultima valutazione del paziente (o del decesso, se applicabile).
• comorbidità: ipertensione arteriosa, diabete, dislipidemia, abitudine al fumo, infezioni gravi, neoplasie, ecc. al momento della diagnosi di LN e al momento dell'ultima valutazione del paziente (o del decesso, se applicabile).
• dati di laboratorio al momento della diagnosi di LN e al momento dell'ultima valutazione del paziente (o del decesso, se applicabile):
• sangue (test generali): reagenti di fase acuta (velocità di eritrosedimentazione e proteina C-reattiva), emocromo completo, creatinina, velocità di filtrazione glomerulare, azoto ureico, test di funzionalità epatica, profilo lipidico.
• sangue (test sierologici): complemento (C3 e C4), livelli di anticorpi anti-dsDNA, anticorpi antifosfolipidi: anticardiolipina (Ig M e Ig G), anti-beta2GP-1 (Ig M e Ig G), lupus anticoagulante.
• urine: ematuria, piuria, proteinuria, cilindri.
• marcatori istopatologici della biopsia renale:
• classe istologica secondo la classificazione ISN/RPS del 2003.
• Indice di attività del National Institutes of Health (NIH): punteggio (massimo 24) e per item (ipercellularità endocapillare, neutrofili/cariorressi, depositi ialini/anse, necrosi fibrinoide, semilune cellulari o fibrocellulari, infiammazione interstiziale).
• Indice di cronicità del National Institutes of Health (NIH): punteggio (massimo 12) e per item (glomerulosclerosi globale, mezzelune fibrose, atrofia tubulare, fibrosi interstiziale).
• marcatori correlati ai linfociti B che possono includere ma non sono limitati a: CD19, CD20 e CD138.
• marcatori correlati a BLyS (stimolatore dei linfociti B) e le sue conseguenze funzionali che possono includere ma non sono limitate all'espressione di BLyS e dei suoi recettori: BAFF-R, BCMA e TACI.
• marcatori correlati ad altri lignaggi cellulari che possono includere ma non sono limitati a: CD3 per cellule T e CD68 per macrofagi.
• marcatori la cui determinazione nelle urine si è dimostrata utile nella diagnosi e nel follow-up di LN che possono includere ma non sono limitati alla citochina proinfiammatoria Monoocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) e alla Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin (NGAL).
• Dati terapeutici LES (compresa la durata del trattamento):
• trattamenti per il LES prima della diagnosi di LN: antimalarici, glucocorticoidi (dose massima), immunosoppressori: azatioprina (AZA), mofetile micofenolato (MMF), ciclofosfamide (CYC); terapie biologiche: belimumab, rituximab.
• trattamento della LN: glucocorticoidi (dose massima), immunosoppressori: AZA, MMF, CYC; terapie biologiche: belimumab, rituximab.
• dati terapeutici delle comorbidità (compresa la durata del trattamento): antipertensivi, antidiabetici orali, insulina, farmaci ipolipemizzanti.
• Evoluzione/prognosi del LES: danno accumulato utilizzando SDI (per item e per dominio), comorbilità accumulate, infezioni gravi, insufficienza d'organo, decesso.

Verranno raccolte le variabili per stabilire diversi modelli di risposta al trattamento e l'evoluzione della LN:

1. risposta renale completa, definita secondo le raccomandazioni EULAR/ERA-EDTA (13): proteinuria <0,5 g/24 ore e GFR stimato (quasi) normale.
2. risposta renale parziale, definita secondo le raccomandazioni EULAR/ERA-EDTA: riduzione della proteinuria ≥50% a livelli subnefrosici e eGFR (quasi) normale
3. nessuna risposta: tutti gli altri casi.
4. livelli di proteinuria a 12 mesi di trattamento,
5. recidiva renale definita come aumento riproducibile di uPCR a >1 g se il valore basale era <0,2 g, a >2 g se il valore basale era compreso tra 0,2 g e 1 g, o più del doppio del valore basale se il valore basale era >1 g E/O una riduzione riproducibile della velocità di filtrazione glomerulare >20%, accompagnata da proteinuria (>1 g) e/o cilindri cellulari di eritrociti e/o leucociti (sì/no e numero di riacutizzazioni), e) tempo alla prima riacutizzazione, f) insufficienza renale cronica,
6. malattia renale allo stadio terminale che richiede dialisi e/o trapianto renale. La raccolta dei dati si baserà sulla storia clinica dei pazienti inclusi nello studio.

La riservatezza sarà rispettata in conformità con il RD 1720/2007 e le leggi sulla protezione dei dati. L'approvazione sarà richiesta dal Comitato etico della ricerca clinica della Galizia (CEIC) e dal CEIC di ciascun centro, se necessario.

STRATEGIA SPERIMENTALE E RAZIONALE In questo progetto utilizzeremo biopsie renali da pazienti con LN. Questi campioni, conservati in formaldeide al 10% e inclusi in blocchi di paraffina dai corrispondenti Servizi di Anatomia Patologica, corrispondono a pazienti con LN sottoposti a biopsia renale nei centri partecipanti al progetto.

BLyS (stimolatore dei linfociti B) svolge un ruolo chiave nella fisiopatologia della LN. Pertanto, in questo studio ci concentreremo sui marcatori correlati a BLyS e alle sue conseguenze funzionali. Da un lato, analizzeremo tra l'altro i livelli di espressione di BLyS e dei suoi recettori (BAFF-R, BCMA e TACI), poiché i livelli di espressione di BLyS e dei suoi recettori sono elevati nelle biopsie sieriche e renali di pazienti con LN e sono associato alla progressione e alla gravità della malattia.

D'altra parte, poiché BLyS induce la sopravvivenza delle cellule B, analizzeremo i livelli di espressione di diversi marcatori delle cellule B come CD19 e CD20 tra gli altri. Infine, analizzeremo il marcatore delle plasmacellule CD138, poiché l'infiltrazione delle plasmacellule è associata ad una maggiore gravità della nefrite da lupus. Analizzeremo i livelli di espressione di marcatori di altri lignaggi cellulari come CD3 per le cellule T e CD68 per i macrofagi.

Analizzeremo anche almeno 2 biomarcatori i cui livelli urinari in pazienti con LN sono stati associati a una prognosi peggiore di LN: la chemochina MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) e l'enzima NGAL (neutrofila gelatinasi-associata lipocalina).

L'espressione di questi marcatori sarà inizialmente determinata mediante colorazione immunoistochimica di biopsie renali, conservate in formaldeide. I campioni saranno colorati e analizzati principalmente nel Servizio di Anatomia Patologica del "Complejo Hospitalario Universitario de Vigo" e nei laboratori dell'"Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur" (IISGS), sebbene i diversi centri partecipanti parteciperanno a questo lavoro nella misura possibile e conveniente per il progetto. Verranno utilizzati diversi metodi di quantificazione in funzione delle colorazioni dei diversi marcatori.

ANALISI STATISTICA Nello studio descrittivo, le variabili numeriche saranno espresse come media ± deviazione standard (SD) o mediana e range interquartile (IQR), a seconda che la distribuzione sia normale o meno, rispettivamente. Stabiliremo 2 gruppi di pazienti, in base alla risposta al trattamento e all'evoluzione clinica del paziente con LN (cioè remissione completa sì/no). Per stabilire le differenze tra i pazienti in questi 2 gruppi, utilizzeremo il test χ2 per variabili categoriche o il test esatto di Fisher quando le frequenze attese sono piccole, il test t-Student per variabili continue normali e il test U di Mann-Whitney per variabili con distribuzione non normale.

Saranno utilizzati diversi metodi per analizzare e/o mitigare il problema dei dati mancanti.

La percentuale di cellule positive e l'intensità della colorazione saranno correlate con i diversi pattern di risposta al trattamento e l'evoluzione della LN.

Verranno eseguite analisi di regressione logistica lineare univariata e multivariata per esplorare le relazioni tra le diverse variabili studiate (cliniche, istopatologiche, terapeutiche...) e la presenza dei diversi esiti renali (variabile dipendente). I valori di p<0.05 saranno considerati significativi.

Effettueremo altri diversi metodi statistici in base ai risultati che osserviamo dalla nostra analisi iniziale.

Le analisi statistiche saranno effettuate dallo Specialista Statistico del Gruppo IRIDIS.

TEMPISTICHE Sviluppo del protocollo definitivo: mese 1. Presentazione e approvazione da parte del Comitato Etico: mesi 1-3. Identificazione e preparazione dei campioni renali: mesi 4-5. Firme del consenso informato: mesi 4-6. Spedizione dei campioni renali: mesi 4-6. Studi anatomo-patologici e di laboratorio: mesi 7-12. Revisione delle cartelle cliniche: mesi 7-12. Monitoraggio della banca dati: mesi 13-15. Analisi statistica: mese 16. Elaborazione della relazione finale: mese 17-18.

TEAM DI RICERCA Sperimentatore principale: Dr. José Mª Pego Reigosa, specialista in reumatologia, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo. Gruppo IRIDIS-VIGO (Indagine in reumatologia e malattie immunomediate), Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur (IISGS).

Ricercatori nel centro di coordinamento: Dr. Irene Altabás González (Reumatologa, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, Gruppo IRIDIS-VIGO), Dr. Noemí Martínez López de Castro (Farmacista Ospedaliero, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, Gruppo IRIDIS-VIGO), Dr. Carmen Fachal Bermúdez (nefropatologa, Complexo Hospitalario Universitario de Vigo) e il Dr. Samuel García Pérez (biologo molecolare, ricercatore senior, gruppo IRIDIS-VIGO).

Centri che collaborano (Reumatologia, Nefrologia, Servizi di anatomia patologica): Hospital 12 de octubre (Madrid, Spagna), Hospital Araba (Vitoria, Spagna), Hospital Germans Trias i Pujol (Barcellona, ​​Spagna), Hospital del Mar (Barcellona, ​​Spagna) e Ospedale Dr. Negrín (Gran Canaria, Spagna).