Влияние беременности и гипертензии, связанной с беременностью, на реактивность маточных миометриальных артерий человека

Предлагаемые здесь эксперименты направлены на выявление механизмов, лежащих в основе изменений реактивности маточных миометриальных артерий человека во время беременности. Первая серия экспериментов будет направлена ​​на изучение изменений, которые наблюдались в отношениях между стрессом и напряжением и ремоделировании артерий во время беременности. Вторая серия экспериментов будет посвящена эндотелиальной зависимости усиленной вазоконстрикции, вызванной беременностью, в миометриальных артериях во время беременности. Наконец, третья серия экспериментов будет направлена ​​на изучение уникальной взаимосвязи между потенциалом покоящейся мембраны, передачей сигналов кальция (Ca2+) и реактивностью сосудов в артериях миометрия у небеременных и беременных женщин.

Забор крови Образцы венозной крови будут взяты у всех пациентов для измерения уровней циркулирующих гормонов и воспалительных маркеров, чтобы можно было надлежащим образом контролировать изменения сосудистой реактивности, связанные с этими компонентами, чтобы правильно охарактеризовать аналогичные изменения, связанные с беременностью и/или экспозицией. к гипертоническому стрессу.

Сбор тканей/амниотической жидкости Образцы при кесаревом сечении: Этот протокол исследования будет включать сбор следующих образцов во время кесарева сечения: образец амниотической жидкости, биопсия плодных оболочек и плаценты, а также полнослойный образец биопсии матки. Нет связанных рисков со сбором амниотической жидкости во время гистеротомии/амниотомии во время кесарева сечения или сбором плаценты и плодных оболочек, отторгнутых в противном случае. Как правило, риск взятия образцов биопсии матки не больше, чем риск кесарева сечения. В настоящее время нет известного риска небольшого количества ткани, которое необходимо взять для биопсии. Может наблюдаться незначительное увеличение частоты и величины кровотечения. Выполнение этих процедур под непосредственным наблюдением еще больше снижает риск кровотечения. Получение этого образца матки добавит минимальное время операции, и все врачи, прошедшие обучение в области акушерства и гинекологии, должны быть в состоянии легко выполнить эту процедуру. Копия имеющегося информированного согласия включена для ознакомления, как и официальный протокол биопсии с подробным описанием процедуры, места взятия образца, размера образца, хранения и т. д. для завершения сбора ткани во время кесарева сечения.

Образцы миометрия после плановой гистерэктомии: этим пациенткам будет проводиться плановая гистерэктомия, которая не зависит от нашего исследования. Исследовательский персонал изолирует образец ткани после хирургического удаления матки. Копия информированного согласия, которое имеется для предлагаемого нами исследования, была включена для рассмотрения, как и официальный протокол, документирующий инструкции по сбору тканей во время доброкачественной плановой гистерэктомии.

Лабораторный анализ После получения собранных образцов тканей ткани будут немедленно помещены в контейнеры с холодным физиологическим раствором (PSS) до тех пор, пока не будет организована их транспортировка в лабораторию Университета Среднего Запада. По прибытии в лабораторию в холодном физиологическом растворе, аэрированном газом, содержащим 21% кислорода (O2), 74% азота (N2) и 5% углекислого газа (~250 микрометров), рассекут миометриальные и плацентарные артерии резистентного размера (~ 250 микрометров). СО2).

Отрезок длиной 1-2 мм будет рассечен, очищен от соединительной ткани и перенесен в лунку артериографа объемом 2 мл. Артерии канюлируют на одном конце, закрепляют швом, осторожно очищают от крови и затем канюлируют на дистальном конце. Данные непрерывно записываются с использованием программного обеспечения для сбора данных (IonOptix Inc., Милтон, Массачусетс, Соединенные Штаты Америки).

Сервосистема давления, подключенная к проксимальной канюле, поддерживает стабильное внутрипросветное давление. Находящиеся под давлением артерии непрерывно переливают физиологическим раствором (8-10 миллилитров в минуту), аэрируя газом, содержащим 21% O2, 74% N2 и 5% CO2 при температуре 37°С (С). После уравновешивания в течение 120 минут для получения стабильного исходного диаметра просвета (LD) миометриальную артерию сужают 50 миллимолярным (мМ) хлоридом калия (KCl) и в присутствии 50 мМ KCl расширяют брадикинином (1 микромолярный мкМ)) для демонстрации интактных гладких мышц сосудов (VSM) и функции эндотелия соответственно. Сосуды, которые не проявляют индуцированного KCl сужения и/или эндотелий-зависимых ответов, будут исключены из дальнейшего исследования. В конце каждого эксперимента определяют пассивный диаметр сосуда, подвергая сосуд воздействию PSS, не содержащего Ca2+, и дилтиазема (80 мМ), ингибитора Ca2+-канала L-типа.

Индуцированные давлением сужения (PIC, от 10 до 100 мм рт. ст.) выражают в виде процентного уменьшения полностью расширенного диаметра отдельных артерий при том же внутрисосудистом давлении. Значения диаметра будут проанализированы как процент сужения или процент изменения тона. Эти значения будут получены с использованием следующих уравнений: % сужения = [(пассивный диаметр - активный диаметр) / пассивный диаметр] X 100]; где пассивный представляет собой пассивный диаметр артерии в ПСШ, не содержащем Са2+, содержащем 80 мМ дилтиазема, а активный диаметр представляет собой диаметр артерии в ответ на ПСШ, содержащий Са2+. Остальные эксперименты будут проводиться при однократном внутрипросветном давлении 60 миллиметров ртутного столба (мм рт. ст.). По возможности диаметр сосудов будет определяться одновременно с записью [Ca2+] и/или внутриклеточной электромиографии (Em).

План эксперимента для оценки влияния следующих ингибиторов на сужение, вызванное давлением: L-NAME (метиловый эфир L-нитроаргинина; для ингибирования NOS), индометацин (INDO, для ингибирования циклооксигеназы (ЦОГ)), GM6001 (для ингибирования матриксных металлопротеиназ). (MMPs)) и ингибиторы калиевых (K+)-каналов на сужение, вызванное давлением. После подтверждения жизнеспособности миометриальной артерии давление в миометриальной артерии будет повышено до 60 мм рт. ст., инкубировано в течение 30 минут в присутствии одного из вышеуказанных ингибиторов и оценено сужение, вызванное давлением (PIC). Реакцию сосуда в присутствии ингибитора анализируют на PIC, как описано выше, и эффект ингибитора путем сравнения сосудистых реакций в его присутствии и в отсутствие.

Стресс против напряжения: вклад эластина и коллагена будет изучен в миометриальной артерии (МА), чтобы определить, способствуют ли изменения в структуре артериальной стенки смещению влево, наблюдаемому в наших предварительных данных. Эти эксперименты будут проводиться аналогично описанному Брионесом и его коллегами. Поскольку многие из ММР (ММР 1, 8 и 12) действуют как коллагеназы или эластазы, это позволит оценить вклад ММР на небеременных и беременных МА с использованием неспецифического ингибитора ММР, GM600157. Вкратце, после получения кривых контрольного давления при внутрипросветном давлении от 10 мм рт.ст. до 140 мм рт.ст. при 37°С в растворе Кребса, содержащем 0 мМ Са2+, ткани будут возвращены к внутрипросветному давлению 60 мм рт.ст., повторно введены к Са2+-содержащему раствору Кребса, содержащему эластазу. , коллагеназы или неспецифического ингибитора MMP GM6001 в течение 60 минут, затем возвращают в раствор Кребса, содержащий 0 мМ Ca2+, плюс ингибитор в течение 20 минут, после чего переоценивают кривые давления. Кривые давления в отсутствие и в присутствии ингибиторов будут сравниваться путем расчета толщины стенки сосуда (WT) и изменения натяжения стенки (дельта-T). Используя программное обеспечение для обнаружения краев и подтвержденное гистологическими методами, WT будет рассчитываться как (внешний диаметр - внутренний диаметр)/2; где WT представляет собой толщину стенки (мкМ), а внешний диаметр и внутренний диаметр представляют собой внешний и внутренний диаметры артериол соответственно (микрометры). Как описано Phillips et. al.63, дельта-Т будет рассчитываться как -1,333 X внутрипросветное давление (PIL) X [(0,5 X Активный внутренний диаметр) - (0,5 X пассивный внутренний диаметр)] X 0,0001; где дельта-T (дин/см) представляет собой разницу в натяжении стенки между «пассивными» (без Ca2+ PSS) и «активными» (Ca2+-содержащими PSS) условиями при заданном внутрипросветном давлении (PIL; мм рт. ст.), а константы 1,333 и 0,0001 являются коэффициентами для преобразования давления в миллиметрах ртутного столба в дин/сантиметр в квадрате и из мкм в см соответственно. Таким образом, дельта-Т представляет собой абсолютную величину, описывающую величину, на которую увеличилось бы пассивное напряжение в сосудистой стенке, если бы все активные сократительные механизмы были подавлены при заданном внутрипросветном давлении. Наконец, для подтверждения функциональных исследований будут использоваться подходы гистологии и молекулярной биологии для оценки экспрессии белка. Во всех экспериментах оценивают толщину артериальной стенки и натяжение стенки.

Измерение Ca2+ в артериальной стенке: для мониторинга изменений цитозольного Ca2+ миометриальную артерию помещают в артериограф объемом 2 миллилитра (мл0) и оставляют для уравновешивания, как описано выше. Загрузка эндотелиальных клеток будет достигнута путем внутрипросветной перфузии артерии Fura-2 (2 микро-М) и плюроновой кислотой (0,05%) в течение 5 минут при комнатной температуре. Просвет будет немедленно промыт PSS в течение дополнительных 10 минут, чтобы удалить Fura-2 из просвета и предотвратить загрузку гладкомышечных клеток сосудов. Загрузка клеток гладкой мускулатуры сосудов будет достигнута путем помещения Fura-2 (2 микро-М) в камеру сосуда при комнатной температуре на 30 мин. После промывки PSS сосуд будет повторно уравновешен в течение 30 минут при 37°С, что позволит Fura-2 деэтерифицировать. Специфичность эндотелиальных и гладкомышечных нагрузок будет определяться с использованием 1 мкМ брадикинина и 50 мМ KCl. Если эндотелий был успешно загружен Fura-2, брадикинин будет вызывать повышение содержания Ca2+ в эндотелиальных клетках и дилатацию артерий. Если гладкие мышцы были успешно нагружены Fura-2, брадикинин вызовет снижение концентрации Ca2+ в артериальной стенке и последующую дилатацию. Добавление 50 мМ K+ будет сужать сосуд и увеличивать содержание Ca2+ в артериальной стенке. Относительное изменение содержания Са2+ в цитозоле будет отслеживаться с использованием микрофлуориметрического оборудования IonOptix, а изменения [Са2+] будут рассчитываться по отношению сигнала возбуждения 340 нм/380 нм.

Электрофизиология - записи внутриклеточной мембраны: сегменты артерий миометрия будут канюлированы аналогично методу, описанному выше. Внутриклеточные измерения будут проводиться через адвентициальную поверхность с помощью микроэлектродов, заполненных 3-молярным KCl, с использованием электрометра Duo 773. Успешные проколы будут оцениваться по быстрому падению потенциала при входе в камеру, низкому уровню шума и минимальному изменению сопротивления электрода и нулевому потенциалу до и после прокола. Сигналы будут просматриваться на цифровом осциллографе (Hitachi), записываться и сохраняться для последующего воспроизведения с использованием программного обеспечения для сбора/анализа IonOptix.

Обзор записей После регистрации участников медицинские записи каждого субъекта исследования будут доступны главному исследователю. Участнику будет присвоен идентификационный номер субъекта исследования, который будет связан с номером медицинской карты пациента только в электронной таблице excel «Основной список участников исследования», хранящейся на защищенном паролем зашифрованном универсальном последовательном шинном накопителе. Затем соответствующие элементы данных будут рассмотрены и помещены в электронную таблицу Excel «Инструмент сбора данных».

Анализ данных Анализ данных будет выполняться исследователями при содействии Департамента биостатистики Медицинского колледжа Университета Аризоны в Фениксе. Характеристики субъектов будут сравниваться с использованием t-критерия или хи-квадрат и сообщаться как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) или 95% доверительные интервалы в зависимости от ситуации. Измерения внутренней сократимости сосудов будут сравниваться между всеми группами субъектов в различных условиях исследования с использованием t-тестов, хи-квадрата и регрессионного анализа, где это уместно. Промежуточный анализ будет проводиться только после того, как будет получен размер выборки не менее 10 полных исследований для каждой группы (случай и контроль).