Raskauden ja raskauteen liittyvän hypertension vaikutus ihmisen kohdun myometriaalivaltimon reaktiivisuuteen

Tässä ehdotetut kokeet pyrkivät tunnistamaan mekanismeja, jotka ovat taustalla muutoksia ihmisen kohdun myometriaalivaltimon reaktiivisuudessa raskauden aikana. Ensimmäisessä koesarjassa käsitellään muutoksia, joita on havaittu stressin ja jännityksen suhteissa ja valtimoiden uusiutumisessa raskauden aikana. Toisessa koesarjassa käsitellään lisääntyneen raskauden aiheuttaman verisuonten supistumisen endoteeliriippuvuutta raskauden aikana myometriumvaltimoissa. Lopuksi kolmannessa koesarjassa käsitellään ainutlaatuista suhdetta lepokalvopotentiaalin, kalsiumin (Ca2+)-signaloinnin ja ei-raskaana olevien ja raskaana olevien naisten myometriumvaltimoiden verisuonten reaktiivisuuden välillä.

Verinäytteet kaikilta potilailta otetaan laskimoverinäytteet verenkierron hormoni- ja tulehdusmerkkiainetasojen mittaamiseksi, jotta näihin komponentteihin liittyviä verisuonten reaktiivisuuden muutoksia voidaan hallita asianmukaisesti, jotta vastaavat joko raskaudesta ja/tai altistumisesta johtuvat muutokset voidaan karakterisoida oikein. hypertensiiviseen stressiin.

Kudos-/lapsivesinäytteet keisarinleikkauksesta: Tämä tutkimusprotokolla sisältää seuraavien näytteiden keräämisen keisarinleikkauksen aikana - lapsivesinäyte, sikiön kalvot ja istukan biopsia sekä täysipaksuinen kohdun biopsianäyte. Lapsiveden keräämiseen ei liity riskejä hysterotomiassa/amniotomiassa keisarinleikkauksen aikana tai muuten poistetun istukan ja sikiön kalvojen keräämiseen. Yleensä kohdun koepalanäytteiden ottamisen riski ei ole suurempi kuin pelkän keisarinleikkauksen. Tällä hetkellä ei ole tunnettua riskiä pienestä kudosmäärästä, joka otetaan biopsialla. Verenvuodon ilmaantuvuus ja laajuus saattaa hieman lisääntyä. Näiden toimenpiteiden suorittaminen suorassa tarkkailussa rajoittaa edelleen tätä verenvuotoriskiä. Tämän kohtunäytteen ottaminen lisää vain minimaalista käyttöaikaa, ja kaikkien synnytys- ja gynekologiakoulutuksen saaneiden lääkäreiden pitäisi pystyä suorittamaan tämä toimenpide helposti. Kopio voimassa olevasta tietoisesta suostumuksesta on mukana tarkastelua varten, samoin kuin muodollinen biopsiaprotokolla, jossa on yksityiskohtaiset tiedot menettelystä, näytepaikasta, näytteen koosta, säilytyksestä jne. kudoskeräyksen suorittamiseksi keisarinleikkauksen yhteydessä.

Myometriaalinäytteet elektiivisestä kohdunpoistosta: Näille potilaille tehdään elektiivinen kohdunpoisto, joka on riippumaton tutkimuksestamme. Tutkimushenkilöstö eristää kudosnäytteen kohdun kirurgisen poiston jälkeen. Kopio tietoisesta suostumuksesta, joka on voimassa ehdotetulle tutkimuksellemme, on sisällytetty tarkistettavaksi, samoin kuin muodollinen protokolla, joka dokumentoi ohjeet kudoskeräyksen loppuun saattamisesta hyvänlaatuisen, elektiivisen kohdunpoiston aikana.

Laboratorioanalyysi Kerättyjen kudosnäytteiden hankinnan jälkeen kudos pannaan välittömästi kylmää fysiologista suolaliuosta (PSS) sisältäviin astioihin, kunnes kuljetus Midwestern Universityn laboratorioon voidaan järjestää. Laboratorioon saavuttuaan resistenssin kokoiset myometrium- ja istukkavaltimot (n. 250 mikrometriä) leikataan kylmässä fysiologisessa suolaliuoksessa, joka on ilmastettu kaasulla, joka sisältää 21 % happea (O2), 74 % typpeä (N2) ja 5 % hiilidioksidia ( CO2).

1-2 mm:n mittainen kappale leikataan, puhdistetaan sidekudoksesta ja siirretään 2 ml:n arteriografin kuoppaan. Valtimot kanyloidaan toisesta päästä, kiinnitetään ompeleella, huuhdellaan varovasti verestä ja kanyloidaan sitten distaaliseen päähän. Tietoja tallennetaan jatkuvasti tiedonkeruuohjelmistolla (IonOptix Inc., Milton, Massachusetts, Yhdysvallat).

Proksimaaliseen kanyyliin yhdistetty paineservojärjestelmä ylläpitää vakaata intraluminaalista painetta. Paineistettuja valtimoita superfuusioidaan jatkuvasti fysiologisella suolaliuoksella (8-10 millilitraa/minuutti), joka on ilmastettu kaasulla, joka sisältää 21 % O2:ta, 74 % N2:ta ja 5 % CO2:ta 37 celsiusasteessa (C). Kun on tasapainotettu 120 minuuttia vakaan perusviivan luumenin halkaisijan (LD) saavuttamiseksi, myometriaalinen valtimo supistuu 50 millimolaarisella (mM) kaliumkloridilla (KCl) ja 50 mM KCl:n läsnä ollessa, sitä laajennetaan bradykiniinillä (1 mikromolaarinen ( uM)) osoittamaan koskemattoman verisuonten sileän lihaksen (VSM) ja endoteelin toiminnan, vastaavasti. Suonet, jotka eivät osoita KCl:n aiheuttamaa supistumista ja/tai endoteeliriippuvaisia ​​vasteita, suljetaan pois jatkotutkimuksesta. Kunkin kokeen lopussa suonen passiivinen halkaisija määritetään altistamalla suoni Ca2+-vapaalle PSS:lle ja diltiatseemille (80 mM), L-tyypin Ca2+-kanavan estäjälle.

Paineen aiheuttamat supistukset (PIC, 10-100 mmHg) ilmaistaan ​​yksittäisten valtimoiden täysin laajentuneen halkaisijan prosentteina samalla suonensisäisellä paineella. Halkaisija-arvot analysoidaan prosentteina supistumis- tai käänteisprosenttina sävyssä. Nämä arvot saadaan käyttämällä seuraavia yhtälöitä: % supistuminen = [(passiivinen halkaisija - aktiivinen halkaisija) / passiivinen halkaisija] X 100]; jossa passiivinen edustaa valtimon passiivista halkaisijaa Ca2+-vapaassa PSS:ssä, joka sisältää 80 mM diltiatseemia, ja aktiivinen halkaisija edustaa valtimon halkaisijaa vasteena Ca2+:a sisältävässä PSS:ssä. Loput kokeet suoritetaan yhdellä intraluminaalisella paineella, joka on 60 elohopeamillimetriä (mm Hg). Aina kun mahdollista, verisuonten halkaisija määritetään samanaikaisesti [Ca2+]- ja/tai solunsisäisten elektromyografisten (Em) tallenteiden kanssa.

Kokeellinen suunnittelu seuraavien estäjien vaikutuksen arvioimiseksi paineen aiheuttamaan supistumiseen: L-NAME (L-nitroarginiinimetyyliesteri; estää NOS:n), indometasiini (INDO, estää syklo-oksigenaasia (COX)), GM6001 (estää matriisin metalloproteinaaseja (MMP:t)) ja kalium (K+) -kanavan estäjät paineen aiheuttamaa supistumista vastaan. Kun myometriaalivaltimon elinkelpoisuus on varmistettu, myometriaalivaltimon paine paineistetaan 60 mmHg:iin, inkuboidaan 30 minuuttia jonkin edellä mainitun inhibiittorin läsnä ollessa ja paine-indusoitu supistuminen (PIC) arvioidaan. Suonen vaste inhibiittorin läsnä ollessa analysoidaan PIC:n suhteen edellä kuvatulla tavalla ja inhibiittorin vaikutus vertaamalla verisuonivasteita sen läsnä ollessa sen puuttuessa.

Stressi vs. rasitus: Elastiinin ja kollageenin vaikutusta myometriaalivaltimoon (MA) tutkitaan sen määrittämiseksi, vaikuttavatko muutokset valtimon seinämän rakenteeseen alustavissa tiedoissamme havaittuun siirtymään vasemmalle. Nämä kokeet suoritetaan samalla tavalla kuin Briones ja kollegansa ovat kuvanneet. Koska monet MMP:istä (MMP 1, 8 ja 12) toimivat kollagenaaseina tai elastaaseina, tämä arvioi MMP:iden vaikutuksen ei-raskaana oleviin ja raskaana oleviin MA:han käyttämällä epäspesifistä MMP-estäjää GM600157. Lyhyesti sanottuna, kun kontrollipainekäyrät on saatu intraluminaalisilla paineilla 10 mmHg - 140 mmHg 37 °C:ssa, 0 mM Ca2+:a sisältävässä Krebs-liuoksessa, kudokset palautetaan 60 mmHg:n intraluminaaliseen paineeseen ja lisätään uudelleen Ca2+:aa sisältävään Krebsiin, joka sisältää elastaasia. , kollagenaasia tai epäspesifistä MMP-estäjää GM6001 60 minuutin ajan, sitten palautetaan 0 mM Ca2+:aa sisältävään Krebs-liuokseen plus inhibiittori 20 minuutiksi, ja painekäyrät arvioidaan uudelleen. Painekäyriä inhibiittoreiden puuttuessa ja läsnä ollessa verrataan laskemalla suonen seinämän paksuus (WT) ja seinämän muutosjännitys (delta-T). Käyttämällä reunantunnistusohjelmistoa ja vahvistettu histologisilla tekniikoilla, WT lasketaan muodossa (ulkohalkaisija - sisähalkaisija)/2; jossa WT edustaa seinämän paksuutta (uM) ja ulkohalkaisija ja sisähalkaisija edustavat valtimoiden ulko- ja sisähalkaisijaa, vastaavasti (mikrometri). Kuten Phillips et. al.63, delta-T lasketaan muodossa -1 333 X intraluminaalinen paine (PIL) X [(0,5 X aktiivinen sisähalkaisija) - (0,5 X passiivinen sisähalkaisija)] X 0,0001; jossa delta-T (dynes/cm) edustaa eroa seinän jännityksessä "passiivisten" (Ca2+-vapaa PSS) vs. "aktiivisten" (Ca2+-pitoinen PSS) välillä tietyssä intraluminaalisessa paineessa (PIL; mmHg), ja Vakiot 1,333 ja 0,0001 ovat tekijöitä paineen muuntamiseksi mmHg:ksi dyneiksi/senttimetri neliöiksi ja µm:stä cm:iksi, vastaavasti. Sellaisenaan delta-T edustaa absoluuttista arvoa, joka kuvaa määrää, jolla verisuonen seinämän passiivinen jännitys lisääntyisi, jos kaikki aktiiviset supistumismekanismit estyisivät tietyssä intraluminaalisessa paineessa. Lopuksi funktionaalisten tutkimusten vahvistamiseksi käytetään histologisia ja molekyylibiologisia lähestymistapoja proteiinin ilmentymisen arvioimiseksi. Valtimon seinämän paksuus ja seinämän jännitys arvioidaan kaikissa kokeissa.

Valtimon seinämän Ca2+-mittaus: Sytosolisen Ca2+:n muutosten seuraamiseksi myometriaalinen valtimo asennetaan 2 millilitran (ml0 arteriografiin) ja sen annetaan tasapainottua edellä kuvatulla tavalla. Endoteelisolujen kuormitus saavutetaan perfusoimalla valtimoon intraluminaalisesti Fura-2:lla (2 mikro-M) ja Pluronihapolla (0,05 %) 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ontelo huuhdellaan välittömästi PSS:llä vielä 10 minuutin ajan Fura-2:n poistamiseksi luumenista ja verisuonten sileän lihassolujen kuormituksen estämiseksi. Verisuonten sileän lihaksen solukuormitus saavutetaan asettamalla Fura-2 (2 mikro-M) suonikammioon huoneenlämpötilaan 30 minuutiksi. PSS:llä huuhtelun jälkeen astian annetaan tasapainottua uudelleen 30 minuuttia 37 Celsius-asteessa, jolloin Fura-2 voi deesteroitua. Endoteeli- ja sileän lihaksen kuormituksen spesifisyys määritetään käyttämällä 1 mikro-M bradykiniiniä ja 50 mM KCl:a. Jos endoteeli on onnistuneesti kuormitettu Fura-2:lla, bradykiniini saa aikaan endoteelisolujen Ca2+ nousun ja valtimoiden laajentumisen. Jos sileä lihas on onnistuneesti kuormitettu Fura-2:lla, bradykiniini saa aikaan valtimon seinämän Ca2+:n laskun ja sitä seuraavan laajentumisen. 50 mM K+:n lisääminen supistaa verisuonia ja lisää valtimon seinämän Ca2+:aa. Sytosolisen Ca2+:n suhteellista muutosta seurataan IonOptix-mikrofluorimetrilaitteilla ja [Ca2+]:n muutokset lasketaan 340 nm/380 nm virityssignaalin suhteesta.

Sähköfysiologia - solunsisäiset kalvotallenteet: myometriaalivaltimon segmentit kanyloidaan samalla tavalla kuin edellä kuvattu menetelmä. Solunsisäiset mittaukset tehdään satunnaisen pinnan läpi mikroelektrodeilla, jotka on täytetty 3-molaarisella KCl:lla, käyttämällä Duo 773 -elektrometriä. Onnistuneet impamentit arvioidaan nopean potentiaalin pudotuksen perusteella kennoon tullessa, alhaisen melutason ja elektrodin resistanssin minimaalisen muutoksen ja nollapotentiaalin perusteella ennen ja jälkeen impamentin. Signaalit tarkastellaan digitaalisella oskilloskoopilla (Hitachi), tallennetaan ja tallennetaan myöhempää toistoa varten IonOptix-hankinta-/analyysiohjelmistolla.

Tietueiden tarkastelu Kun osallistuja on ilmoittautunut, päätutkija pääsee käsiksi kunkin tutkimushenkilön sairaustietoihin. Osallistuja saa tutkimushenkilön tunnistenumeron, joka linkitetään potilaan potilastietonumeroon vain 'Study Participant Master List' excel-taulukossa, jota ylläpidetään salasanalla suojatulla, salatulla yleissarjaväyläasemalla. Tämän jälkeen asiaankuuluvat tietoelementit tarkistetaan ja tiivistetään "Tietojenkeruutyökalun" Excel-laskentataulukkoon.

Tietojen analysointi Tutkimustutkijat suorittavat data-analyysin Arizonan yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun Phoenixin biostatistiikkaosaston avustuksella. Koehenkilön ominaisuuksia verrataan käyttämällä t-testejä tai chi-neliötä ja raportoitava keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM) tai 95 %:n luottamusvälit tarpeen mukaan. Suonen sisäisen supistumisen mittauksia verrataan kaikkien koeryhmien välillä erilaisissa tutkimusolosuhteissa käyttämällä t-testejä, khi-neliö- ja regressioanalyysiä tarvittaessa. Välianalyysi suoritetaan vain, kun jokaisesta ryhmästä (tapaus ja kontrolli) saadaan vähintään 10 täydellisen tutkimuksen otoskoko.