Effekten av graviditet og graviditetsassosiert hypertensjon på human uterin myometrial arteriereaktivitet

Eksperimentene som er foreslått her søker å identifisere mekanismer som ligger til grunn for endringer i human uterus myometrial arterie-reaktivitet under graviditet. Den første serien med eksperimenter vil være å adressere endringene som har blitt observert i stress-belastningsforhold og arteriell ombygging under graviditet. Den andre serien av eksperimenter vil ta for seg endotelavhengigheten av forsterket graviditet-indusert vasokonstriksjon i myometriale arterier under graviditet. Til slutt vil den tredje serien av eksperimenter være å adressere det unike forholdet mellom hvilemembranpotensial, kalsium (Ca2+) signalering og vaskulær reaktivitet i myometriale arterier fra ikke-gravide og gravide kvinner.

Blodprøver Venøse blodprøver vil bli samlet inn fra alle pasienter for måling av sirkulerende hormon- og inflammatoriske markørnivåer, slik at vaskulære reaktivitetsendringer relatert til disse komponentene kan kontrolleres på riktig måte for å korrekt karakterisere lignende endringer som kan tilskrives enten graviditet og/eller eksponering til hypertensivt stress.

Innsamlingsprøver av vev/fostervann fra keisersnitt: Denne forskningsprotokollen vil inkludere innsamling av følgende prøver ved keisersnitt - fostervannsprøver, fostermembraner og placentabiopsi, og en livmorbiopsiprøve i full tykkelse. Det er ingen assosiert risiko med oppsamling av fostervann på tidspunktet for hysterotomi/amniotomi under keisersnitt eller oppsamling av ellers kassert morkake og fostermembraner. Generelt er ikke risikoen for å ta livmorbiopsiprøver større enn ved et keisersnitt alene. På dette tidspunktet er det ingen kjent risiko for den lille mengden vev som skal tas ved biopsi. En svak økning i forekomsten og omfanget av blødninger kan forekomme. Utførelse av disse prosedyrene under direkte observasjon begrenser denne blødningsrisikoen ytterligere. Innhenting av denne livmorprøven vil kun legge til minimal operasjonstid, og alle leger med opplæring i obstetrikk og gynekologi bør være i stand til å utføre denne prosedyren enkelt. En kopi av det informerte samtykket som er på plass er inkludert for gjennomgang, det samme er en formell biopsiprotokoll som beskriver prosedyren, prøvestedet, prøvestørrelsen, oppbevaringen osv. for å fullføre vevsinnsamlingen ved tidspunktet for keisersnitt.

Myometrieprøver fra elektiv hysterektomi: Disse pasientene vil gjennomgå en elektiv hysterektomi som er uavhengig av vår studie. Forskningspersonell vil isolere vevsprøven etter kirurgisk fjerning av livmoren. En kopi av det informerte samtykket som er på plass for vår foreslåtte studie er inkludert for gjennomgang, i likhet med en formell protokoll som dokumenterer instruksjoner for å fullføre vevsinnsamlingen på tidspunktet for benign, elektiv hysterektomi.

Laboratorieanalyse Ved anskaffelse av innsamlede vevsprøver vil vev umiddelbart plasseres i beholdere med kald fysiologisk saltløsning (PSS) inntil transport til laboratoriet ved Midwestern University kan ordnes. Ved ankomst til laboratoriet vil resistensstore myometriske og placentale arterier (~250 mikrometer) dissekeres i kald fysiologisk saltvannsoppløsning luftet med gass som inneholder 21 % oksygen (O2), 74 % nitrogen (N2) og 5 % karbondioksid ( CO2).

En 1-2 mm lengde vil bli dissekert, renset for bindevev og overført til brønnen på en 2 mL arteriograf. Arteriene kanyleres i den ene enden, festes med sutur, skylles forsiktig fri for blod og deretter kanyleres i den distale enden. Dataene registreres kontinuerlig ved hjelp av programvare for datainnsamling (IonOptix Inc., Milton, Massachusetts, USA).

Et trykk-servosystem koblet til den proksimale kanylen opprettholder et stabilt intraluminalt trykk. Arterier under trykk superfuses kontinuerlig med fysiologisk saltvannsløsning (8-10 milliliter/minutt) luftet med gass som inneholder 21 % O2, 74 % N2 og 5 % CO2 ved 37 Celsius (C). Etter ekvilibrering i 120 minutter for å oppnå en stabil baseline lumendiameter (LD), vil myometriearterien bli innsnevret med 50 millimolar (mM) kaliumklorid (KCl) og i nærvær av 50 mM KCl, utvidet med bradykinin (1 mikromolar ( uM)) for å demonstrere henholdsvis intakt vaskulær glatt muskel (VSM) og endotelfunksjon. Fartøy som ikke viser KCl-indusert innsnevring og/eller endotelavhengige responser vil bli ekskludert fra videre studier. Ved slutten av hvert eksperiment bestemmes den passive diameteren til karet ved å eksponere karet for Ca2+-fri PSS og diltiazem (80 mM), en L-type Ca2+-kanalhemmer.

Trykkinduserte innsnevringer (PIC, 10 til 100 mmHg) uttrykkes som en prosentvis reduksjon av den fullstendig utvidede diameteren til individuelle arterier ved samme intravaskulære trykk. Diameterverdier vil bli analysert som prosentvis innsnevring eller prosent reversering i tone. Disse verdiene vil bli oppnådd ved å bruke følgende ligninger: % innsnevring = [(passiv diameter - aktiv diameter) / passiv diameter] X 100]; der passiv representerer den passive diameteren til arterien i Ca2+-fri PSS som inneholder 80 mM diltiazem, og aktiv diameter representerer diameteren til arterien som respons i Ca2+-holdig PSS. De resterende eksperimentene vil bli utført ved et enkelt intraluminalt trykk på 60 millimeter kvikksølv (mm Hg). Når det er mulig, vil vaskulær diameter bli bestemt samtidig med [Ca2+] og/eller intracellulære elektromyografiske (Em) registreringer.

Eksperimentell design for å vurdere effekten av følgende hemmere på trykkindusert innsnevring: L-NAME (L-nitro arginin metylester; for å hemme NOS), indometacin (INDO, for å hemme cyklooksygenase (COX)), GM6001 (for å hemme matrisemetalloproteinaser (MMPs)) og kalium (K+)-kanalhemmere på trykkindusert innsnevring. Etter bekreftelse av myometrial arteriens levedyktighet, vil myometrial arterien settes under trykk til 60 mm Hg, inkuberes i 30 minutter i nærvær av en av de ovennevnte inhibitorene, og trykkindusert innsnevring (PIC) vurderes. Responsen til karet i nærvær av inhibitoren vil bli analysert for PIC som beskrevet ovenfor og effekten av inhibitoren ved å sammenligne vaskulære responser i dens nærvær vs. fravær.

Stress vs. belastning: Bidraget til elastin og kollagen vil bli undersøkt i myometrial arterie (MA) for å avgjøre om endringer i arteriell veggstruktur bidrar til venstreforskyvningen observert i våre foreløpige data. Disse eksperimentene vil bli utført på en måte som ligner den som er beskrevet av Briones og kolleger. Siden mange av MMP-ene (MMP 1, 8 og 12) fungerer som kollagenaser eller elastaser, vil dette vurdere bidraget til MMP-er på ikke-gravide og gravide MA ved bruk av den ikke-spesifikke MMP-hemmeren, GM600157. Kort fortalt, etter å ha oppnådd kontrolltrykkkurver ved intraluminale trykk fra 10 mmHg til 140 mmHg ved 37C, i en 0 mM Ca2+-holdig Krebs-løsning, vil vev bli returnert til et intraluminalt trykk på 60 mmHg, re-introdusert til Ca2+-holdige Krebs som inneholder elastase , kollagenase eller den ikke-spesifikke MMP-hemmeren GM6001 i 60 minutter, deretter returnert til 0 mM Ca2+-holdig Krebs-løsning pluss inhibitoren i 20 minutter, og trykkkurvene vil bli revurdert. Trykkkurver i fravær og tilstedeværelse av inhibitorer vil sammenlignes ved å beregne karveggtykkelse (WT) og endre veggspenning (delta-T). Ved å bruke kantdeteksjonsprogramvaren og bekreftet av histologiske teknikker, vil WT bli beregnet som (ytre diameter - indre diameter)/2; der WT representerer veggtykkelse (uM) og ytre diameter og indre diameter representerer arteriolær ytre og indre diameter, henholdsvis (mikrometer). Som beskrevet av Phillips et. al.63, vil delta-T beregnes som -1333 X intraluminalt trykk (PIL) X [(0,5 X Aktiv indre diameter) - (0,5 X passiv indre diameter)] X 0,0001 ; hvor delta-T (dynes/cm) representerer forskjellen i veggspenning mellom "passive" (Ca2+-fri PSS) vs. "aktive" (Ca2+-holdige PSS) forhold ved et gitt intraluminalt trykk (PIL; mmHg), og konstantene 1,333 og 0,0001 er faktorer for å konvertere trykk i mmHg til henholdsvis dyn/centimeter i kvadrat og fra µm til cm. Som sådan representerer delta-T den absolutte verdien som beskriver hvor mye den passive spenningen i vaskulærveggen ville økes hvis alle aktive kontraktile mekanismer ble hemmet ved et gitt intraluminalt trykk. Til slutt, for å bekrefte funksjonelle studier, vil histologiske og molekylærbiologiske tilnærminger bli brukt for å vurdere proteinuttrykk. Arteriell veggtykkelse og veggspenning vil bli vurdert i alle forsøk.

Måling av arterievegg Ca2+: For å overvåke endringer i cytosolisk Ca2+, vil myometrial arterie monteres i en 2-milliliter (mL0 arteriograf og få lov til å ekvilibrere som beskrevet ovenfor. Endotelcellebelastning vil oppnås ved å perfuere arterien intraluminalt med Fura-2 (2 mikro-M) og Pluronsyre (0,05%) i 5 minutter ved romtemperatur. Lumen vil umiddelbart skylles med PSS i ytterligere 10 minutter for å fjerne Fura-2 fra lumen og forhindre vaskulær belastning av glatte muskelceller. Vaskulær glattmuskelcellebelastning vil bli oppnådd ved å plassere Fura-2 (2 mikro-M) i karkammeret ved romtemperatur i 30 min. Etter skylling med PSS, vil fartøyet få lov til å re-ekvilibrere i 30 minutter ved 37 Celsius, slik at Fura-2 kan avesterifiseres. Spesifisiteten til endotel- og glattmuskelbelastning vil bli bestemt ved bruk av 1 mikro-M bradykinin og 50 mM KCl. Hvis endotelet har blitt vellykket lastet med Fura-2, vil bradykinin fremkalle en økning i endotelcelle Ca2+ og arteriell dilatasjon. Hvis den glatte muskelen har blitt vellykket belastet med Fura-2, vil bradykinin fremkalle en reduksjon i arteriell vegg Ca2+ og påfølgende dilatasjon. Tilsetning av 50 mM K+ vil innsnevre karet og øke arterieveggen Ca2+. Den relative endringen i cytosolisk Ca2+ vil bli overvåket ved hjelp av IonOptix mikrofluorimetriutstyr og endringer i [Ca2+] vil bli beregnet fra forholdet mellom 340 nm/380 nm eksitasjonssignalet.

Elektrofysiologi - intracellulære membranregistreringer: myometriske arteriesegmenter vil bli kanylert tilsvarende metoden beskrevet ovenfor. Intracellulære målinger vil bli gjort gjennom adventitialoverflaten med mikroelektroder fylt med 3 molar KCl ved bruk av et Duo 773 elektrometer. Vellykkede impalements vil bli bedømt på grunnlag av et raskt fall i potensialet ved inntreden i cellen, et lavt støynivå og minimal endring i elektrodemotstanden og nullpotensial før og etter impalement. Signaler vil bli sett på et digitalt oscilloskop (Hitachi), tatt opp og lagret for senere avspilling ved hjelp av IonOptix innsamlings-/analyseprogramvare.

Gjennomgang av journal Ved deltakerregistrering vil hovedetterforskeren få tilgang til medisinske journaler for hvert studieobjekt. Deltakeren vil få et identifikasjonsnummer for studieemnet som vil være knyttet til pasientens journalnummer kun i Excel-regnearket 'Studiedeltaker-masterliste', vedlikeholdt på en passordbeskyttet, kryptert universell seriell bussstasjon. Relevante dataelementer vil deretter bli gjennomgått og abstrahert til Excel-regnearket 'Data Collection Tool'.

Dataanalyse Dataanalyse vil bli utført av studieforskerne med bistand fra Institutt for biostatistikk ved University of Arizona College of Medicine - Phoenix. Emnekarakteristikker vil bli sammenlignet ved bruk av t-tester eller chi square og rapportert som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM) eller 95 % konfidensintervaller etter behov. Målinger av indre karkontraktilitet vil bli sammenlignet mellom alle faggrupper under de ulike studiebetingelsene ved bruk av t-tester, kjikvadrat og regresjonsanalyse der det er hensiktsmessig. Interimanalyse vil kun finne sted når en prøvestørrelse på minst 10 komplette studier er oppnådd for hver gruppe (tilfelle og kontroll).